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Tiques et maladies à tiques

 | 
Karen D. McCoy
, 
Nathalie Boulanger

Boîte à outils

Annexe 5

Identification moléculaire de l’hôte du repas sanguin d’une tique

Sébastien Masséglia et Gwenaël Vourc’h

Texte intégral

1Identifier l’hôte du repas sanguin d’un arthropode vecteur est essentiel pour étudier l’évolution et le comportement des arthropodes hématophages, ainsi que pour comprendre l’épidémiologie et l’émergence d’une maladie vectorisée dans un écosystème donné. Du début du XXe siècle à aujourd’hui, l’identification de l’hôte du repas sanguin a été réalisée par des techniques sérologiques telles que le test aux précipitines (dos Santos Silva et al., 2012) ou la méthode ELISA (Marassa et al., 2008). À présent, l’utilisation de techniques de génotypage de l’hôte à partir des restes du repas sanguin se généralise.

2Pour les moustiques, la réussite du génotypage de l’hôte du repas sanguin dépend de la durée de la période de digestion ; l’efficacité de l’amplification décline fortement après trente heures de digestion (Oshaghi et al., 2006b). Pour les tiques, génotyper le dernier hôte qui a pris son repas plusieurs mois avant d’être collecté semble un défi bien plus important. Cependant, la faisabilité a été démontrée par analyse de nymphes d’I. ricinus jusqu’à cinq mois après le gorgement des larves (Kirstein et Gray, 1996). L’objet de cette revue bibliographique, à l’instar de précédents travaux (Mukabana et al., 2002 ; Wells et Stevens, 2008 ; Kent, 2009), est de réaliser l’inventaire des différentes méthodes de génotypage de l’hôte du repas sanguin d’arthropodes hématophages, et plus particulièrement de tiques.

Choix des marqueurs génétiques

Les marqueurs mitochondriaux

3La majorité des travaux sur les tiques mettant en œuvre des techniques de génotypage de l’hôte du repas sanguin utilisent des gènes mitochondriaux (ADNmt) comme marqueur. La mitochondrie, organite intracellulaire eucaryote, dispose de son propre génome circulaire. Elle est présente par centaines dans une cellule de vertébré, ce qui facilite l’amplification par PCR à partir d’un nombre limité de cellules. De plus, certains gènes ADNmt présentent un taux d’évolution important et peuvent donc différencier les vertébrés (Sorenson et al., 1999 ; Hebert et al., 2003). Pour la plupart des vertébrés, de nombreuses copies de pseudo-gènes mitochondriaux inclus dans le génome nucléaire (Bensasson et al., 2001) peuvent induire des erreurs dans le génotypage (Song et al., 2008) ; il est possible de bloquer l’amplification de ces pseudo-gènes (Egizi et al., 2013).

ADNmt cytb

4L’ADNmt cytb codant le cytochrome b est le marqueur mitochondrial de vertébrés dont les séquences sont les plus abondantes dans GenBank®, ce qui facilite le génotypage par comparaison de séquences et la réalisation d’alignements pour dessiner de nouveaux couples d’amorces. L’ADNmt cytb a été le premier gène utilisé pour identifier des restes de repas sanguin de tiques (Tobolewski et al., 1992). De nombreuses solutions ont été proposées pour amplifier les ADNmt cytb de vertébrés (Kocher et al., 1989 ; Galan et al., 2012 ; Naidu et al., 2012), notamment pour identifier l’origine du repas sanguin d’arthropodes hématophages dont les tiques (Gray et al., 1999 ; Pierce et al., 2009).

ADNmt COI

5L’ADNmt COI codant le cytochrome c oxidase I est le marqueur génétique qui a été proposé pour le projet de normalisation de l’identification génétique des animaux intitulé « DNA bar coding » (Hebert et al., 2003 ; Waugh, 2007). Un système informatique de gestion de séquences de référence d’ADNmt COI a été mis en ligne. Il permet l’accès à des données complètes sur la taxonomie et l’origine de l’animal à partir duquel une séquence d’ADNmt COI a été obtenue (Ratnasingham et Hebert, 2007). En banque, les séquences de référence d’ADNmt COI sont moins abondantes que les séquences d’ADNmt cytb. L’utilisation de l’ADNmt COI comme marqueur pour génotyper les hôtes de repas sanguin des tiques (Gariepy et al., 2012) reste limitée.

ADNr 12s et 16s

6Les ADNr 12s et 16s sont les gènes qui codent les ARN ribosomaux 12s et 16s. Les ADNr 12s et 16s présentent des régions très conservées qui ont permis le dessin d’amorces vertébrées universelles non dégénérées (Humair et al., 2007 ; Kitano et al., 2007). Ces marqueurs sont réputés avoir un taux d’évolution plus faible que les ADNmt cytb et COI (Hebert et al., 2003), donc de ne pas permettre une différenciation entre espèces aussi fine. Mais cette affirmation est controversée (Ficetola et al., 2010). Un des principaux freins à l’utilisation des deux ADNr du génome mitochondrial comme marqueur pour génotyper des résidus de repas sanguin est le manque de séquences de vertébrés référencés dans les banques de gènes. Cependant, l’ADNr 16s (Allan et al., 2010 ; Mans et al., 2013) et l’ADNr 12s (Moran Cadenas et al., 2007 ; Goessling et al., 2012 ; Scott et al., 2012) sont significativement utilisés comme marqueurs pour identifier l’origine du repas des tiques. Par contre, ils sont peu employés pour identifier l’origine des repas de la plupart des autres arthropodes hématophages.

Les marqueurs nucléaires

7Les gènes codant pour les ARN ribosomaux sont également présents en plusieurs centaines de copies dans le génome nucléaire des vertébrés. Leur amplification par PCR est donc aussi sensible que l’amplification des marqueurs mitochondriaux. Initialement l’ADNr 18s a été utilisé comme marqueur, car il présente des régions conservées qui facilitent le dessin d’amorces vertébrées universelles (Pichon et al., 2003). D’autres marqueurs nucléaires sont rarement utilisés parmi lesquels le gène codant pour la prépronociceptine présente en une seule copie dans le génome nucléaire de mammifères (Haouas et al., 2007) ou les SINEs (short interspersed nuclear elements), courtes séquences répétées dont plusieurs centaines de copies sont réparties dans le génome des eucaryotes (Pizarro et al., 2007).

Les outils de génotypage d’un marqueur

8L’extraction d’ADN à partir de l’arthropode et l’amplification d’un marqueur génétique sont les étapes clés préalables à chaque méthode de génotypage des résidus du repas sanguin. L’extraction d’ADN a un effet direct sur la sensibilité de la PCR (Martinezde la Puente et al., 2013). De plus, c’est essentiellement au cours de la collecte des échantillons, puis de l’extraction, que le risque de contamination par l’ADN humain est le plus fort. L’amplification des contaminants environnementaux est d’autant plus forte que la PCR est sensible. S’il y a contamination, les résultats désignant l’homme ou la famille des mammifères comme origine du repas sanguin doivent être retirés (Humair et al., 2007). Le degré de spécification de l’hôte du repas sanguin, taxon, genre ou espèce, dépend plus du choix du marqueur amplifié que de l’outil utilisé pour le génotyper. Pour s’affranchir de l’effet négatif de la digestion du repas sur la sensibilité d’amplification, il est préférable de cibler des fragments de courte taille, moins susceptibles d’être fragmentés (Zaidi et al., 1999). Les amorces utilisées ne doivent pas permettre l’amplification de fragments d’ADN de l’arthropode étudié.

Séquençage

9Le séquençage par la méthode de Sanger est l’approche la plus utilisée pour identifier spécifiquement une séquence amplifiée à partir des restes de repas sanguin d’arthropodes hématophages. L’identification par alignement à des séquences de référence est réalisable sans connaissance a priori des hôtes potentiels. La possibilité de repas multiples ou de contaminations environnementales impose la réalisation d’étapes de clonage avant le séquençage, ce qui alourdit la méthode et la rend plus coûteuse. Son faible débit n’est compatible qu’à l’analyse d’un nombre limité d’individus dans le cadre d’études exploratoires (Mans et al., 2013). Les techniques de séquençage de nouvelle génération, dont le débit d’analyse ne cesse d’augmenter et le coût de baisser, sont une alternative séduisante à la méthode de Sanger qui permettrait d’analyser simultanément plusieurs centaines de tiques (Pompanon et al., 2012).

Hybridation à des sondes spécifiques

Hybridations à des sondes fixées en ligne sur une membrane (Reverse Line Blot)

10L’utilisation de la Reverse Lime Blot (RLB) impose la connaissance a priori des hôtes potentiels du repas sanguin, afin de sélectionner des sondes oligonucléotidiques spécifiques qui seront fixées en ligne sur une membrane. La spécificité de la sonde dépend du polymorphisme du marqueur génétique qui sera amplifié et biotinylé par PCR : taxon pour l’ADNr 18s (Pichon et al., 2003), genre ou espèce pour l’ADNr 12s (Humair et al., 2007) et l’ADNmt cytb (Abbasi et al., 2008). La capacité du marqueur amplifié à s’hybrider à la sonde qui lui est complémentaire est révélée à l’aide de streptavidine marquée et permet d’identifier l’animal hôte du repas sanguin avec beaucoup de sensibilité. Cette méthode est la seule à être utilisée pour l’analyse d’un grand nombre de tiques non gorgées collectées sur le terrain. Son efficacité semble variable suivant le mois de collecte (Moran Cadenas et al., 2007), les espèces de tiques étudiées, leur stade de développement et le marqueur ciblé (tabl. 1).

Hybridation à une sonde fixée sur des microsphères

11Cette solution est proposée pour pallier le faible débit d’analyse de la RLB tout en suivant le même principe. Chaque sonde oligonucléotidique ciblant un hôte potentiel du repas sanguin est fixée sur une microsphère portant un marqueur qui la caractérise. Plus d’une centaine de microsphères marquées différemment sont disponibles, donc plus d’une centaine de sondes peuvent être utilisées simultanément. Le produit de PCR biotinylé obtenu à partir des résidus de repas sanguin est déposé dans une solution contenant 5 000 exemplaires de chacune des différentes microsphères. L’hybridation par complémentarité du produit de PCR sur la microsphère spécifique d’un hôte est révélée à l’aide d’une streptavidine marquée, puis détectée automatiquement par un lecteur (Thiemann et al., 2012).

Amorces spécifiques d’hôtes

12Plusieurs couples d’amorces sont dessinés pour amplifier par PCR multiplex des fragments dont la taille est spécifique des hôtes ou des groupes d’hôtes sur lesquels l’arthropode étudié est susceptible de réaliser son repas sanguin. La fiabilité et la précision des résultats obtenus dépendent de la spécificité des amorces utilisées. Cette méthode est facile à mettre en œuvre et peu coûteuse. (Ngo et Kramer, 2003 ; Garros et al., 2011). Le suivi de l’amplification au cours de la PCR, à l’aide de sondes Taqman ou Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) spécifiques d’hôtes potentiels, permet de s’affranchir de l’électrophorèse nécessaire pour déterminer la taille des fragments amplifiés. Le nombre d’hôtes ou de groupe d’hôtes ciblés au cours d’une PCR est limité au nombre de fluorophores utilisables simultanément (van den Hurk et al., 2007 ; Woods et al., 2009).

Analyse d’hétéroduplex

13Un fragment d’ADNmt cytb de vertébré est amplifié par PCR à partir des résidus du repas sanguin de l’arthropode analysé, et parallèlement, à partir d’un animal quelconque, le conducteur. Les produits de PCR obtenus à partir de l’hôte et du conducteur sont mélangés et leurs brins d’ADN sont désappariés à haute température. Par un refroidissement lent à température ambiante, les brins se rapparient pour former une proportion de deux types d’héteroduplex « hôte-conducteur » dont les structures tridimensionnelles sont différentes de celles des homoduplex « hôte » et « conducteur ». Les hétéroduplex et les homoduplex sont séparés par électrophorèse sur un gel d’acrylamide contenant de l’urée. Le profil obtenu, spécifique de l’hôte, peut être identifié en le comparant à des profils de référence réalisés antérieurement sur les animaux susceptibles d’être hôtes du repas sanguin (Boakye et al., 1999).

Polymorphisme de restriction (Restriction Fragment Length Polymorphism)

14La digestion d’un marqueur génétique, en général une portion de l’ADNmt cytb, par des enzymes de restriction génère des fragments d’ADN de différentes tailles que l’on peut visualiser par électrophorèses d’ADN en gel d’agarose. In silico, il est possible de prédire les profils de restriction des animaux susceptibles d’être hôtes du repas sanguin et de choisir le marqueur et les enzymes de restriction les plus adaptés pour les différencier. L’hôte du repas sanguin est identifié en comparant le profil de restriction obtenu à partir des résidus du repas sanguin et les profils de référence. Outre son faible débit, cette méthode a plusieurs inconvénients : l’amplification et la digestion de pseudo-gènes peuvent fausser le profil de restriction (Steuber et al., 2005) ; l’analyse d’une séquence de plus de 300pb facilite la discrimination des profils de restriction de nombreux hôtes potentiels, mais la sensibilité de l’amplification est très dépendante de la qualité des résidus du repas sanguin (Oshaghi et al., 2006a) ; l’analyse d’une séquence courte de moins de 100pb facilite l’amplification à partir de résidus dégradés, mais complique la réalisation du profil de restriction, car il est difficile de déterminer les tailles de petits fragments en gel d’agarose (Fornadel et Norris, 2008).

Analyse à haute résolution de la température de fusion (High‑Resolution Melting)

15Cette technique permet de déterminer l’hôte du repas sanguin d’un arthropode en amplifiant un marqueur génétique par PCR à l’aide d’amorces vertébrées universelles, en présence d’un fluorophore intercalant, le SYBR Green. La température de fusion de la séquence de vertébrés amplifiée, déterminée précisément par analyse de sa courbe de dénaturation thermique, est comparée aux températures de fusion de séquences d’espèces-hôtes potentielles du repas sanguin (Pena et al., 2012).

Conclusions

16Actuellement, le génotypage par RLB de l’ADNr 12s de vertébrés (Humair et al., 2007) est la technique la plus utilisée pour identifier l’origine du repas sanguin de tiques. Les solutions alternatives au génotypage impliquant l’utilisation de la spectrométrie de masse (Wickramasekara et al., 2008 ; Schmidt et al., 2011 ; Onder et al., 2013) sont coûteuses et complexes, mais pourraient être complémentaires (GomezDiaz et Figuerola, 2010). En prenant les précautions nécessaires pour s’affranchir des biais liés à l’amplification de pseudo-gènes ou de contaminants environnementaux, le génotypage d’ADNmt à l’aide de nouvelles méthodes de séquençage semble être la solution d’avenir pour identifier les hôtes de repas sanguins de population de tiques. De telles solutions sont d’ores et déjà mises en œuvre, par exemple, pour génotyper des rongeurs ou identifier des résidus de tissus dans les fèces de carnivores (Galan et al., 2012).

Tableau 1. Utilisation de la RLB pour identifier l’hôte du repas sanguin de tiques, en quête d’hôte, collectées sur le terrain.

Marqueur
ciblé

Tique étudiée

N tiques
analysées

N repas
identifiés
( %)

N repas
multiples**

Réf.

ADNmtcytb
(
Kirstein et
Gray, 1996)

Ixodes ricinus

80 nymphes

27 (33,8 %)

2

Gray et al., 1999

ADNr 18s
(
Pichon
et al., 2003)

Ixodes ricinus

49 nymphes
322 nymphes
60 nymphes
61 nymphes

26 (53 %)
159 (49,4 %)
20 (33,3 %)
22 (36 %)

-
2
0
-

Pichon et al., 2003
Pichon et al., 2005
Pichon et al., 2006
EstradaPeña
et al., 2005

Amblyomma
americanum

1 383 nymphes

869 (62 %)

141

Allan et al., 2010

ADNr 12s
(
Humair
et al., 2007)

Ixodes ricinus

55 nymphes
26 femelles
28 males

21 (38,2 %)
17 (65,4 %)
15 (53,6 %)

2
1

Humair et al.,
2007

897 nymphes
429 adultes

364 (40,6 %)
214 (49,9 %)

71
40

Moran Cadenas
et al., 2007

399 nymphes

105 (26,3 %)

-

Bown et al., 2009

Amblyomma
americanum

98 nymphes
141 femelles
150 mâles

59 (60,2 %)
73 (51,8 %)
78 (52,0 %)

14
14
5

Scott et al., 2012

Ixodes scapularis

79 adultes

42 (53,1 %)

4

Scott et al., 2012

** Résidus de repas sanguin provenant de plusieurs hôtes.

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Auteurs

UR 0346 Unité Épidémiologie animale Centre Auvergne-Rhône-Alpes, site de Theix 63122 Saint-Genès-Champanelle. sebastien.masseglia@clermont.inra.fr

© IRD Éditions, 2015

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