Introduction

1Les milieux extrêmes sont, fréquemment, caractérisés par des écosystèmes stables marqués par la présence d'au moins un facteur aux limites de la tolérance pour la plupart des organismes. Par contre, la majorité des milieux terrestres et aquatiques comportent des écosystèmes fluctuants présentant une grande variabilité des facteurs chimiques et physiques.

2On considère que les écosystèmes stables sélectionnent des organismes à spectres étroits de tolérance (Alexander, 1971), alors que les espèces des écosystèmes fluctuants sont elles capables de s'adapter aux changements continus soit des teneurs en éléments nutritifs, soit des conditions physiques. Les sols tropicaux, parfois les milieux les plus productifs du monde, peuvent également devenir les lieux les plus défavorables à la vie des micro-organismes. Les principaux facteurs limitant l'activité biologique dans les sols tropicaux sont la sécheresse, la salinité, les hautes températures, les pH extrêmes acides ou alcalins et les carences en éléments nutritifs (Henzell, 1988). Ces sols sont souvent influencés par de nombreux facteurs interagissants (Skujins, 1984) susceptibles de réduire la croissance et la capacité de survie des organismes (Saxena et Rewari, 1992). Aux facteurs abiotiques, il faut encore ajouter les facteurs biotiques négatifs comme la compétition, la prédation, etc.

3Dans de tels habitats, la capacité de survie d'une souche bactérienne dépend de sa capacité à croître à un taux suffisant pour compenser la mort causée par les facteurs précédemment recensés (Henzell, 1988).

4En ce qui concerne la symbiose légumineuses-bactéries du genre Rhizobium, le facteur susceptible d'entraver la fixation d'azote n'est généralement pas l'absence de souches bactériennes efficientes, mais un ou plusieurs facteurs écologiques qui en limitent les potentialités (Alexander, 1985). Les divers stress biotiques et abiotiques peuvent agir à différents niveaux et réduire le taux de croissance ainsi que la capacité de survie des rhizobia à l'état saprophytique (en absence de la plante hôte). Ces stress peuvent interférer avec les processus d'infection ou de nodulation, ou encore influencer l'activité fixatrice d'azote après établissement de la symbiose (Hirsch, 1996).

5Le recours à des légumineuses pérennes peut se révéler être une stratégie intéressante pour la réhabilitation des zones tropicales et sub-tropicales affectées par les processus de désertification ayant provoqué la perte de fertilité (Herrera et al., 1993 ; Giller et Cadish, 1995 ; Danso et al., 1992 ; Diagne, 1988). Les légumineuses infestées avec des souches effectives de rhizobia peuvent en effet garantir un rendement plus élevé et une amélioration du bilan azoté de ces sols appauvris (Dreyfus et Dommergues, 1981 ; Ndoye et al., 1995 ; Cornet et al., 1985 ; Lal et Khanna, 1994). Il faut pour cela que la souche bactérienne choisie entraîne une nodulation effective, qu'elle soit capable de survivre dans des conditions environnementales défavorables, de se reproduire et de coloniser les racines. Les souches doivent donc posséder les caractéristiques requises pour s'adapter aux diverses contraintes de l'environnement.

6Si la résistance des souches de rhizobia infestant les légumineuses des climats tempérés aux facteurs défavorables est déjà amplement étudiée, les connaissances relatives aux souches tropicales sont en revanche encore très fragmentaires. Dans ce travail, nous relatons les résultats d'expériences visant à étudier la réponse de souches de rhizobia collectées dans des sols de zones arides du Sénégal et de Tunisie aux stress de l'environnement naturel.

La résistance aux contraintes abiotiques

7Le potentiel hydrique du sol peut influencer la symbiose entre les légumineuses et les rhizobia et, dans des conditions de sécheresse élevée, la nodulation peut être faible et/ou inefficiente. La sécheresse peut aussi influencer la survie des rhizobia pendant leur vie saprophytique (Chao et Alexander, 1982). En outre, l'aridité peut inhiber la fixation d'azote, la nitrogénase étant très sensible à des variations, même faibles, du potentiel osmotique du sol (Sinclair et al., 1987). Vu qu'environ 15 % des sols des zones arides peuvent subir un excès de salinité, la tolérance au stress salin est une propriété très importante pour la survie au stade saprophytique et la compétitivité des rhizobia tropicaux. Les sols salins, qui se forment en général dans des conditions d'aridité élevée et de hautes températures, sont souvent alcalins et peuvent présenter une disponibilité réduite en phosphore, fer, zinc et manganèse. Une interaction entre salinité, pH et températures élevées peut avoir des effets plus néfastes sur la symbiose que chacun de ces facteurs pris séparément (Elsheikh et Wood, 1989 a). Le sel exerce un double effet sur les microbes : un effet spécifique dû à la toxicité des ions et un second lié au potentiel osmotique (Brown, 1976). Toutefois, le stress hydrique étant en général de durée limitée, il suffit que les micro-organismes puissent y survivre un certain laps de temps. Le stress salin est lui permanent et les micro-organismes doivent s'y adapter afin non seulement de survivre mais aussi de se reproduire (Sprent, 1984 ; Zaharan, 1992).

8Sous les tropiques, la température peut atteindre 65-70 °C à la surface du sol et 50 °C dans les horizons inférieurs. Ces températures élevées inhibent généralement la croissance des micro-organismes. Ainsi chez les rhizobia les hautes températures peuvent empêcher la nodulation et inhiber la fixation d'azote (Day et al., 1978). Une tolérance à 42,5 °C a été fréquemment signalée pour R. meliloti. Une résistance à des températures variant entre 44 °C à 47 °C chez certaines souches isolées au Kenya (Zhang et al., 1991) et au Soudan (Shoushtari et Pepper, 1985) a même été observée. La température optimale pour la croissance des rhizobia varie selon la zone climatique où ils sont isolés. L'adaptation à des températures au-dessus de 40 °C peut permettre à certaines souches isolées au Sahel nigérien de maintenir et parfois d'augmenter l'activité de fixation symbiotique de l'azote (Eaglesham et Ayanaba, 1984).

9Pour évaluer la réponse de rhizobia tropicaux à des facteurs abiotiques typiques extrêmes tels qu'une salinité et des températures élevées, nous avons isolé des souches de rhizobia à partir des nodules d'Acacia tortilis subsp raddiana. Ces souches ont été cultivées sur des sols recueillis au Sénégal et en Tunisie. De plus, nous avons examiné des souches rhizobiales, de la collection du Laboratoire de microbiologie du sol de l'IRD de Dakar, appartenant à trois groupes taxono-miques : Sinorhizobium saheli (groupe SA), Sinorhizobium terangae (groupe S) et les espèces appartenant au cluster U (De Lajudie et al., 1994). Toutes les souches, à l'exception de trois d'entre elles provenant d'un échantillon de profondeur du site de Louga (Sénégal), se sont révélées capables de se multiplier à 40 °C. La moitié des souches montrait une croissance à 42,5 °C. Cinq croissaient encore à 45 °C, dont deux souches provenant d'un sol aride, deux d'un sol salin et une d'un isolat de surface (fig. I).

10Nous avons testé la résistance au sel de toutes les souches en évaluant leur croissance en présence de concentrations croissantes de NaCl. En outre, nous avons étudié la tolérance des rhizobia à la sécheresse en utilisant des solutés qui réduisent la disponibilité en eau du milieu de culture (Al-Rashidi et al., 1982).

11La tolérance des rhizobia à des concentrations de NaCl > 1,5 % est rare, même si certaines souches sont capables de croître en présence de 2 % de NaCl (HUA et al., 1982 ; Zhang et al., 1991 ; Ghittoni et Bueno, 1995) et qu'un isolat obtenu sur Prosopis sp. a toléré 3 % de NaCl (Karanja et Wood, 1988).

12Alors que la majorité des isolats des sols du Sénégal montre une croissance à 1% de NaCl et que certains peuvent tolérer 1,5 % (St-Louis, Souilène, Mbouba) et 2 % (St-Louis), les souches provenant de Tunisie sont déjà inhibées à une concentration de 1% (fig. 2).

13Les isolats appartenant aux trois groupes taxonomiques de la collection IRD ont des sensibilités différentes au sel (fig. 3). Les plus tolérants sont les isolats du groupe S qui croissent à 2 % de NaCl, suivis par ceux du groupe A, parmi lesquels 45 % tolèrent 1,5 % de NaCl et plus de 30 % croissent en présence de 1% de sel. Le groupe SA est le plus hétérogène, mais près de la moitié des souches est déjà inhibée à une concentration de 1,5 %.

14Le stress osmotique causé par la présence de polyéthylène-glycol, retenu, parmi les polymères de faible masse moléculaire, pour réduire le potentiel osmotique, se révélait être moins inhibiteur pour la croissance des bactéries que le stress salin (fig. 2 et 3). Cela confirme qu'à potentiel égal, l'effet toxique dû aux ions est plus important que l'effet osmotique du sel (Elsheikh et Wood, 1989 b).

15L'étude de la croissance des isolats de rhizobia, à différentes concentrations de NaCl, montre que l'effet du sel influence surtout la phase de latence, qu'elle ralentit en comparaison avec le témoin. Ces observations sont confirmées par les courbes de croissance obtenues pour 13 souches témoins inoculées dans un thermoturbidimètre à trois concentrations différentes de sel. La détermination des effectifs de bactéries se développant dans le turbidimètre à des concentrations différentes de NaCl, montre que la présence du sel dans le milieu réduit les taux de croissance et allonge le temps de latence. Cela confirme les résultats obtenus pour d'autres souches de rhizobia (Singleton et al., 1982 ; Elsheikh et Wood, 1989 a ; Craig et al., 1991 ; Ghittoni et Bueno, 1995).

16Les courbes de croissance d'une souche de Rhizobium (souche 1230), cultivée sur deux milieux de culture de niveau nutritionnel contrasté (riche [YMB] et pauvre [MB7]) et en présence de concentrations différentes de sel, sont illustrées figure 4. La détermination des effectifs de bactéries a été réalisée d'après le modèle logistique (Zwietering et al., 1990).

17L'effet du sel sur la phase de latence et sur le taux de croissance est surtout marqué pour les cultures sur le milieu le plus pauvre (fig. 4, MB7), ce qui suggère que la tolérance de Rhizobium au sel dépend aussi de la composition du milieu de culture.

La résistance aux conditions de l'oligotrophie

18Dans la majorité des sols tropicaux les facteurs limitants les plus importants sont, indépendamment du potentiel osmotique, la faible teneur en azote et en matière organique. Cette situation est imputable aux facteurs environnementaux et aux interférences de l'homme sur le développement des systèmes végétaux naturels (Wani et al., 1995).

19Il a été évalué que la perte moyenne annuelle des sols tropicaux en azote est de l'ordre de 78 à 570 kg.ha^-1, alors que sous climats tempérés elle n'atteint que 30-50 kg (Döbereiner et Pedrosa, 1987).

20En général, dans les sols portant une végétation non perturbée, les teneurs en substances organiques présentent une limite déterminée par la productivité et la nature du système végétal en place. Dans les conditions extrêmes des sols tropicaux, l'équilibre climat-végétation-sol peut être altéré par des facteurs abiotiques et biotiques. En effet, en plus des interventions néfastes de l'homme, la vitesse des processus de minéralisation et l'effet lessivant des précipitations modifient les caractéristiques physiques et chimiques du sol, en provoquant un épuisement progressif en substances nutritives. Dans ces conditions, aux limites de l'oligotrophie, les micro-organismes du sol doivent adopter des stratégies particulières pour survivre et rivaliser avec les autres organismes coexistant dans le même habitat. Le processus de survie d'une souche dans des conditions d'absence de sources d'énergie est très important en écologie microbienne. Il représente un mécanisme de conservation d'un génome qui ainsi subsistera et sera à nouveau capable de s'exprimer lorsque les conditions environnementales redeviendront favorables (Morita, 1982).

21Les bactéries du genre Rhizobium montrent, en général, une faible persistance dans les sols, ce qui peut entraîner une nodulation insatisfaisante des légumineuses et une réduction conséquente de leur productivité (Evans et al., 1993 b). Il semble aussi que, pour une même espèce de Rhizobium, l'aptitude à survivre varie avec le type du sol.

22Les causes les plus importantes de réduction du nombre de rhizobia dans les sols (entraînant en conséquence une nodulation insuffisante), sont l'aridité, un pH au-dessous de 4,6 et une température trop élevée (Evans et al., 1988 ; Evans et al., 1993 a).

23La survie des souches de rhizobia peut varier en fonction de la proximité des racines. La rhizosphère est un habitat particulièrement favorable à la croissance des rhizobia et l'on a pu démontrer une augmentation sensible de la population de rhizobia dans le sol rhizosphérique comparé au sol sans racines. Le niveau de cette stimulation dépend de l'environnement, du type du sol, de l'espèce végétale, de l'âge des plantes et de la souche de Rhizobium (Hlrsch, 1996).

24La compétence écologique (Weller, 1988) est la capacité d'un organisme à survivre et à croître à l'état naturel, en particulier dans la rhizosphère ; elle représente donc l'aptitude de cet organisme à coloniser les racines. Pour qu'une bactérie puisse coloniser une racine, elle doit posséder un ensemble de traits physiologiques caractéristiques (Weller, 1988 ; Hozore et Alexander, 1991) et manifester un large spectre de tolérance aux contraintes abiotiques (Alexander, 1971).

25Nous avons choisi, afin d'évaluer son aptitude à survivre et à se développer à l'état saprophytique dans la rhizosphère, la souche de Rhizobium (1230) isolée à partir d'un sol aride, sablonneux et pauvre en matière organique du Sénégal. Cette souche tolère également les hautes températures, des niveaux de NaCl jusqu'à 2 %, et un bas potentiel osmotique (Grego et al., 1995). Cette souche a, par la suite, été inoculée sur deux échantillons d'un sol similaire et de même origine que celui d'où elle a été isolée. Les deux échantillons de sol - dont l'un a été prélevé autour des jeunes racines d'un individu d'Acacia raddiana et l'autre à une distance de 30 m du tronc de la même plante - ont été stérilisés par radiation pour assurer la croissance de la souche en absence de compétition.

26L'évolution de la densité de la souche de Rhizobium a été appréciée grâce à des évaluations périodiques, selon les techniques soit du dénombrement direct au microscope à l'épifluorescence (Keppner et Pratt, 1994), soit par la technique indirecte de l'ensemencement sur un milieu gélosé. L'évaluation du nombre de bactéries métaboliquement actives a été effectuée par dénombrement direct au microscope [épifluorescence, coloration avec l'orange d'acridine, incubation en présence de 2-(p-iodophényl)-3-(p-nitrophényl)-5-phényl tétrazolium chlorure (INT)] (Fry, 1990).

27Après un déclin initial, les bactéries introduites dans le sol rhizosphérique commencent à se reproduire, et quelques heures après l'inoculation, la population métaboliquement active augmente largement, alors que, dans le même temps, le même inoculum introduit dans le sol sans racines régresse sensiblement (fig. 5). En outre, les comptages des colonies, sur le milieu gélosé, ont révélé que presque toutes les bactéries métaboliquement actives avaient la capacité de se reproduire.

28Les différences obtenues, sur sol stérilisé, entre l'essai avec le sol rhizosphérique et le témoin sans racines peuvent, globalement, être attribuées aux différences relevées entre les teneurs en matière organique, en azote et en phosphore des deux échantillons (Grego et al., cet ouvrage)1. Le sol prélevé à 30 m de la plante était en effet bien plus pauvre en substances nutritives que le sol rhizosphérique. D'autre part, la forte densité des populations bactériennes hétérotrophes et oligotrophes, liée à une teneur plus élevée en azote dans le sol rhizosphérique que dans le sol témoin, conforte ces résultats et confirme que la présence, à proximité de la racine, de substances aisément métabolisables, peut aider les rhizobia à survivre et, parfois, à se reproduire. La persistance de bactéries métaboliquement actives dans le sol rhizosphérique suggère en outre que pour les rhizobia cet état physiologique peut représenter une stratégie de survie dans le sol (Roszak et Colwell, 1987).

29La capacité des bactéries du genre Rhizobium à survivre a été étudiée en laboratoire dans des conditions de privation de nutriments et, parfois, en présence de contraintes abiotiques. Clarke et al. (1993), par exemple, ont montré l'effet mortel d'un double choc limitation du carbone et faible pH sur la survie d'une souche de Rhizobium meliloti.

30Pour ce qui concerne la souche 1230, cultivée avec le mannitol comme seul facteur carboné et en présence ou en absence de NaCl à 2 %, la survie, en réponse à une condition soudaine de privation totale de nutriments, semble être liée au taux de croissance et à la présence du sel dans le tampon utilisé pour l'incubation (fig. 6) (Lippi et al., 2000). Les résultats, qui rejoignent ceux relatifs à d'autres micro-organismes (Garcia-Lara et al., 1993 ; Gauthier et al., 1989 ; Hofle, 1984 ; Moyer et Morita, 1989 ; Munro et al., 1987 ; Cacciari et al., 1995), suggèrent qu'un des facteurs les plus importants pour la survie est l'histoire physiologique de la souche bactérienne, c'est-à-dire les conditions de culture précédant le stress de la privation totale de nutriments (Gottshall, 1990).

31Les populations adaptées à la salinité sont par ailleurs plus aptes à survivre au double choc de la concentration élevée en sel et de la faible disponibilité en carbone que les autres populations. Les cellules précédemment cultivées sur un milieu salé ont apparemment acquis une plus grande résistance, même à la privation en nutriments. Cependant, si, outre la privation des nutriments, on ajoute du sel dans le tampon d'incubation, les cellules (= les souches) ne sont pas plus résistantes que celles n'ayant subi aucune adaptation (c. à d. préalablement cultivées en milieu salin).

32Quoique perdant rapidement leur viabilité, les populations soumises au double choc montrent par contre une extraordinaire aptitude à reprendre leur croissance lorsqu'elles sont à nouveau inoculées dans un milieu de culture salé. Leurs taux de croissance (fig. 6) sont bien plus élevés que ceux obtenus en inoculant, dans les mêmes conditions de culture, les populations pendant leur phase exponentielle de croissance. En outre, cette souche de Rhizobium peut encore être mise en culture avec succès après quatre mois d'incubation, en présence comme en absence de NaCl (Lippi et al., 2000).

33L'interprétation de ces résultats suggère que la résistance aux concentrations élevées en sel peut représenter pour les rhizobia tropicales un trait important pour leur survie durant de longues périodes d'inanition et pour leur reproduction en conditions de salinité et de sécheresse. Cela confirme également leur capacité à persister pendant longtemps dans le sol puis à croître rapidement dans la rhizosphère quand les conditions sont appropriées (Hirsch, 1996). La capacité d'un organisme à supporter les stress abiotiques est aussi liée à son état physiologique et à la possibilité qu'il a de moduler ses réponses aux contraintes de l'environnement naturel.

La compétition

34Pour qu'une implantation réussisse, il importe que les bactéries inoculées survivent dans le nouvel environnement. Il est toutefois difficile, du fait de la grande hétérogénéité du milieu qui peut empêcher les bactéries d'atteindre et d'occuper les microhabitats les plus propices à leur survie (Postma et al., 1989), de prévoir le taux de survie des souches introduites dans un sol. Les différentes souches de rhizobia coexistant simultanément dans un sol présentent des différences de capacité à rivaliser pour l'occupation des nodules, et le succès dans la symbiose est influencé par les facteurs environnementaux, la plante hôte, la taille initiale de la population de rhizobia et sa répartition dans le sol (Heijnen et Van Veen, 1991 ; Postma et al., 1989). À ces contraintes, il faut ajouter la prédation, surtout par les protozoaires, qui est souvent responsable du déclin des rhizobia, après leur introduction dans le sol (Habte et Alexander, 1977). Les autres facteurs biotiques qui peuvent réduire le nombre des rhizobia incluent les bactériophages, les parasites comme le Bdellovibrio (Keya et Alexander, 1975), les antibiotiques produits par d'autres micro-organismes et les bactériocines produites par d'autres rhizobia (Hirsch, 1979). Une résistance intrinsèque aux antibiotiques peut donc être importante, du point de vue écologique, pour les micro-organismes du sol, en raison d'une compétitivité plus élevée et d'une plus grande aptitude à survivre, principalement dans les sites arides où la sécheresse et le pH alcalin favorisent la croissance d'actinomycètes producteurs d'antibiotiques.

35En ce qui concerne les isolats provenant des sols du Sénégal et de la Tunisie et les souches de la collection du Laboratoire de microbiologie du sol de l'IRD de Dakar, la résistance intrinsèque aux antibiotiques a été déterminée par l'addition de 9 antibiotiques au milieu de culture (tabl. I et II) (Grego et al., 1995). Les isolats provenant des sites tunisiens sont, globalement, tolérants à tous les antibiotiques, bien qu'à différents degrés. Les isolats provenant des sites sénégalais ne présentent eux que de faibles niveaux de résistance, à part quelques isolats résistants à un seul antibiotique. La sensibilité aux antibiotiques, plus élevée chez les souches sénégalaises que chez les souches tunisiennes, peut être imputée à la biomasse microbienne moins abondante dans la rhizosphère des Acacia raddiana de Tunisie (Grego et al, 1995).

Tableau I – Résistance aux antibiotiques des souches de rhizobia isolées dans des sols du Sénégal et de Tunisie.

Tableau II – Résistance aux antibiotiques des souches de rhizobia appartenant à la collection IRD.

Conclusion

36Les rhizobia tropicaux présentent des caractéristiques physiologiques qui peuvent contribuer à leur survie dans les environnements peu hospitaliers des sols tropicaux. Leur résistance à plusieurs stress abiotiques et leur amplitude écologique sont en faveur de leur utilisation pour les essais d'inoculation des légumineuses pérennes dans les programmes de reforestation. Cependant, une meilleure survie ne signifie pas obligatoirement qu'une fois introduits dans la rhizosphère, ces rhizobia soient capables de s'établir et d'atteindre les sites de la nodulation. Pour qu'elle puisse stimuler le développement de la plante, toute souche isolée doit : I ) être adaptée aux conditions du sol ; 2) être une fixatrice d'azote efficiente en symbiose avec la plante hôte ; 3) être capable de s'établir en gagnant la compétition avec les populations rhizobiales indigènes (Giller et Cadish, 1995). Plusieurs chercheurs ont orienté leurs recherches vers la manipulation génétique des rhizobia afin de leur faire acquérir certaines propriétés spécifiques et améliorer ainsi leurs performances de souches inoculantes. Par contre, beaucoup d'autres optent pour l'utilisation des souches « site-spécifiques », c'est-à-dire indigènes de l'habitat où elles doivent être inoculées. L'adaptation à un ou plusieurs stress abiotiques augmente l'aptitude d'un organisme et peut contribuer à son succès dans la compétition pour atteindre les sites de pénétration racinaires (Elsheikh et Wood, 1995 ; Zou et al., 1995). En effet, le stress dû à la compétition et à l'antagonisme microbien s'ajoute souvent aux stress liés aux conditions parfois extrêmes du milieu ; la résultante définit le degré de compétitivité d'une souche. L'étude de la physiologie des rhizobia face aux contraintes environnementales peut apporter des indications utiles pour une meilleure compréhension des stratégies qu'elles adoptent pour résister aux conditions de privation de nutriments et être capables, les conditions redevenant favorables, de reprendre une activité et d'atteindre les sites de nodulation.

Auteurs

37I. Cacciari, E. Di Mattia, P. Quatrini, M. Moscatelli et S. Grego

38DABAC, Universita della Tuscia, 01 100 Viterbo, Italie

39D. Lippi,

40M. R. De Paolis

41IBEV-CNR, Area Ricerca di Roma, Monterotondo Scalo, Italie