Introduction

1Comme de nombreuses plantes de la famille des Légumineuses, la plupart des espèces d'Acacia natives d'Afrique peuvent développer des nodules sur leurs racines et établir ainsi une relation symbiotique fixatrice d'azote avec des bactéries du sol communément appelées rhizobium (Harrier et al., 1995). L'établissement et le fonctionnement de cette symbiose sont le résultat d'une interaction moléculaire entre la plante et la bactérie, contrôlée au niveau génétique par chacun des deux partenaires. Les plantes sécrètent des flavonoïdes qui, lorsqu'ils sont reconnus par le rhizobium, déclenchent la biosynthèse bactérienne de molécules lipo-oli-gosaccharidiques appelées facteurs Nod. Ceux-ci induisent chez la plante la formation d'un organe spécialisé, le nodule, à l'intérieur duquel la bactérie se différencie en bactéroïde capable de fixer l'azote atmosphérique (Denarie et al., 1996 ; Spaink, 1996).

2Il a longtemps été communément admis que les arbres, en particulier les acacias, étaient nodulés par des rhizobia à croissance lente, mais Trinick (1965, 1968 et 1980) a montré par la suite que des souches à croissance rapide étaient capables de noduler certains arbres appartenant aux genres ieucaena, Mimosa, Acacia et Sesbania.

3En ce qui concerne A. tortilis (Forssk.) Hayne subsp. raddiana (Savi) Brenan au Sénégal, nos premières études avaient montré que l'espèce était nodulée par des rhizobia à croissance rapide (Dreyfus et Dommergues, 1981). Depuis cette époque, la taxonomie bactérienne a fait de grands progrès, devenant « polyphasique » en prenant en compte tout un ensemble de caractéristiques phénotypiques et génotypiques (Vandamme et al., 1996). La classification de ces rhizobia à croissance rapide s'est ainsi considérablement affinée (Young et Haukka, 1996), et on y distingue maintenant quatre genres : Rhizobium (Jordan, 1982), Azorhizobium (Dreyfus et al., 1988), Sinorhizobium (De Lajudie et al., 1994) et Mesorhizobium (Jarvis et al., 1997). Phylogénétiquement, les genres Rhizobium et Sinorhizobium sont proches du genre Agrobacterium (Wlllems et Collins, 1993), Mesorhizobium est proche de Phyllobacterium, (Jarvis et al., 1997) et Azorhizobium est proche de Xanthobacter (Rainey et Wiegel, 1996).

4Il est ainsi apparu qu'une même plante peut s'associer avec plusieurs types de microsymbiontes. Le soja (Glycine max) peut être nodulé par 6 espèces appartenant à 3 genres différents : Bradyrhizobium japonicum, B. elkanii, 8. liaoningense, Sinorhizobium fredii, S. xinjiangensis et Mesorhizobium tianshanense ; Sesbania rostrata peut être nodulé par trois espèces appartenant à deux genres différents : Sinorhizobium saheli, S. terangae et (Dreyfus et al., 1988 ; De Lajudie et al., 1994 ; Truper et De Clari, 1997) ; les souches isolées d'Acacia sont génétiquement diverses et appartiennent aux genres Bradyrhizobium (Dreyfus et Dommergues, 1981; Dupuy et al., 1994), Sinorhizobium (De Lajudie et al., 1994 ; Lortet et al., 1996 ; Nick et al., 1995,1999), et Mesorhizobium (De Lajudie et al., 1998 b).

5Cependant, des tests de nodulation réalisés avec une collection de rhizobia isolés d'Acacia et de Sesbania et appartenant aux espèces Sinorhizobium saheli, S. terangae et Mesorhizobium plurifarium ont montré que, malgré cette diversité taxonomique, les isolats d'une même plante présentent une spécificité d'hôte équivalente. Parmi différents marqueurs moléculaires de la nodulation évalués, seuls les profils chromatographiques des facteurs Nod ont regroupé les souches en fonction de leur spectre d'hôte. Il a été proposé d'utiliser l'analyse chromatographique des facteurs Nod comme méthode de caractérisation symbiotique des rhizobia permettant l'analyse de leur diversité symbiotique (Lortet et al., 1996) et de l'associer à la taxonomie pour la description de biovars à l'intérieur de l'espèce (souches de la même espèce mais de spécificités d'hôte différentes). Nous rapportons dans cette étude un ensemble de données sur la nodulation d'A. tortilis subsp. raddiana en utilisant 54 souches de diverses provenances de notre collection et 76 nouveaux isolats de nodules d'A. tortilis subsp. raddiana provenant de diverses régions de son aire de répartition naturelle, notamment au nord et au sud du Sahara. La diversité des nouveaux isolats a été évaluée d'un point de vue taxonomique par les techniques de RAPD (Random Amplified Polymorphism DNA) et SDS-PAGE (analyse des protéines cellulaires totales sur gel de polyacrylamide-SDS), et d'un point de vue symbiotique par l'étude de leurs spectres d'hôtes, de leur efficience et de l'analyse de leurs facteurs Nod.

Constitution d'une collection d'isolats d'A. tortilis subsp. raddiana

6Il est rare de trouver des nodules d'arbre dans la nature, et extrêmement difficile d'apporter la preuve que des nodules mis en évidence dans un sol appartiennent de fait à l'arbre qui se trouve à proximité. Cela nous a contraints à utiliser une procédure de « piégeage à partir du sol », bien que celle-ci constitue un biais par rapport à l'isolement direct à partir d'un nodule prélevé sur le terrain. L'isolement a été effectué à partir de nodules formés sur des individus d'A. tortilis subsp. raddiana inoculés in vitro avec des échantillons de sols prélevés dans diverses régions : pour le nord du Sahara, la station de Haddej, en Tunisie ; pour le sud du Sahara, les sols ont été prélevés dans le sud de la Mauritanie et au Sénégal ; ces sols représentent divers écosystèmes, jusqu'à des zones salées, et sont issus de prélèvements effectués à différentes profondeurs, jusqu'à – 32 mètres. Au total, 76 nouveaux isolats d'A. tortilis subsp. raddiana ont ainsi été obtenus (tabl. I).

Analyse moléculaire de la diversité taxonomique

7En accord avec nos précédents travaux (Dreyfus et Dommergues, 1981), toutes les souches que nous avons isolées de A. tortilis subsp. raddiana peuvent être considérées comme des rhizobia à croissance rapide, puisqu'elles forment des colonies en 48 heures sur milieu YMA. Pour caractériser ces souches, nous avons employé deux techniques dont le niveau de résolution se situe entre la souche et l'espèce (Vandamme et al., 1996) ; l'une, relativement récente, est génotypique (RAPD, Random Amplified Polymorphic DNA), et l'autre phénotypique (analyse des profils de protéines totales par SDS-PAGE).

Tableau I – Liste des souches.

Tableau I (suite).

Tableau I (suite).

Tableau I (suite).

Tableau I (suite).

Tableau I (suite).

Tableau I (suite et fin).

RAPD

8Afin d'évaluer le degré de diversité génomique des nouveaux isolats obtenus à partir de nodules d'A. tortilis subsp. raddiana, 43 d'entre eux ont été analysés par une technique RAPD modifiée en utilisant deux combinaisons d'amorces (Williams et al., 1990). Les résultats montrent une grande diversité génomique puisque aucun profil complet n'est conservé parmi les isolats. Les isolats de Tunisie forment un groupe qui semble diverger de ceux formés par les isolats du Sénégal (fig. I). Cependant, le pouvoir discriminant de cette technique s'est avéré trop fin pour une technique de groupage ; nous avons donc employé une autre technique, l'analyse des protéines cellulaires totales par SDS-PAGE, déjà éprouvée dans le cas des rhizobia (Moreira et al., 1993 ; De Lajudie et al., 1994, 1998 a, 1998 b).

SDS-PAGE

9La technique SDS-PAGE est simple et rapide, très informative (au niveau de l'espèce) et nous disposons d'une importante base de données avec de nombreuses souches de référence (De Lajudie et al., 1994, 1998 a, 1998 b). Les protéines cellulaires totales sont purifiées à partir d'une culture bactérienne et séparées sur gel de polyacrylamide en présence de SDS (SDS-PAGE). Chaque étape de l'expérimentation est réalisée dans des conditions très standardisées. Le profil électrophorétique obtenu pour chaque souche est digitalisé, normalisé et analysé à l'aide du logiciel GelCompar (Applied Maths, Kortrijk, Belgique), et confronté à la base de données.

10L'analyse des isolats de A. tortilis subsp. raddiana par la technique SDS-PAGE a confirmé la diversité mise en évidence par RAPD en faisant apparaître une grande hétérogénéité de profils électrophorétiques. Les résultats, illustrés par la figure 2, montrent qu'une vingtaine de ces souches sont regroupées avec les souches de référence de S. terangae, S. fredii, et M. plurifarium, suggérant que ces souches appartiennent à ces espèces. Les 56 autres souches sont réparties dans six groupes différents de ceux formés par les espèces décrites. Certains d'entre eux pourraient représenter des groupes nouveaux, mais leur place taxonomique reste à préciser par des techniques complémentaires. Des expériences préliminaires de séquençage d'une partie du gène codant pour l'ARNr 16S et d'hybridations ADN/ADN ont, jusqu'à présent, confirmé ces résultats.

Relation entre taxonomie et origine écologique, géographique et édaphique de la souche

11Aucune relation n'a pu être établie entre l'origine géographique et écologique et le groupe électrophorétique des souches d'A. tortilis subsp. raddiana. Les souches tunisiennes, mauritaniennes et sénégalaises se groupent en mélange, notamment dans S. terangae. Certaines souches provenant de zones salées de la région de St-Louis (Sénégal) forment les groupes 1 et 2, mais d'autres appartiennent à différents groupes comprenant des souches d'autres provenances. À l'intérieur du groupe de M. plurifarium sont retrouvées des souches de diverses profondeurs (0-15 cm, 50-100 cm, 31-32 m), suggérant l'identité des populations de rhizobia en surface et en profondeur, de façon analogue à ce qui avait été montré dans le cas des souches de Bradyrhizobium de Faidherbia albida par Dupuy et al. (1994).

Analyse de la diversité symbiotique

Spectre d'hôte des isolats d'A. tortilis subsp. raddiana et nodulation d'A. tortilis subsp. raddiana

12Lortet et al. (1996) ont montré que les souches isolées de divers Acacia (A. Senegal, A. tortilis subsp. raddiana, A. laeta, A. mollissima, A. horrida, A. seyal) nodulent Acacia tortilis ainsi que Leucaena leucocephala et Prosopis juliflora.

13Nous avons donc testé 13 nouveaux isolats d'A. tortilis subsp. raddiana pour leur capacité à noduler A. raddiana, A. Senegal, Prosopis juliflora et Leucaena leucocephala. Le test que nous avons utilisé pour cela est celui décrit par Gibson (1963) qui consiste à inoculer la racine d'une jeune plante bactériologiquement stérile en croissance dans un tube avec une culture de la souche à tester (6 à 8 répétitions par souche). Les 13 isolats testés (voir fig. 3) nodulent A. tortilis subsp. raddiana, A. Senegal et L leucocephala et également P. juliflora, à l'exception de la souche RAT 902.

14L'étude comparative des cinétiques de nodulation d'A. tortilis subsp. raddiana par chacun de ces 13 isolats montre que le nombre de nodules observés après 30 jours de culture est très variable d'une souche à l'autre, de quelques nodules à plus de 30 nodules par plante (fig. 3). Parmi elles, les 3 souches originaires de Tunisie testées induisent moins de 7 nodules par plante. La représentation de la cinétique de la fixation d'azote mesurée par l'ARA montre une courbe en cloche dont la valeur maximale se situe entre 24 et 27 jours après l'apparition des nodules (N'Diaye, 1996).

15En parallèle, nous avons testé 54 souches de rhizobia de diverses provenances (plantes, régions) et de divers groupes taxonomiques pour leur capacité à induire la nodulation d'A. tortilis subsp. raddiana (tabl. II). Les souches trouvées capables de noduler A. tortilis subsp. raddiana sont en majorité des souches isolées à l'origine de plantes des genres Acacia, Prosopis, Leucaena et Neptunia et appartenant à S. terangae biovar acaciae, M. plurifarium et une nouvelle espèce (De Lajudie et al., 1998 a). La souche de Sinorhizobium sp. NGR 234, à large spectre d'hôte, et la souche de R.tropici CFN 299 plus quelques autres souches non classées sont également capables d'induire la nodulation chez A. tortilis subsp. raddiana. Les souches de S. terangae biovar sesbaniae sont particulières en ce sens qu'elles sont capables d'induire une nodulation faible et retardée sur A. tortilis subsp. raddiana Les résultats de ce criblage des souches de collection sur plantes indiquaient sept souches qui donnaient le meilleur effet sur la croissance de la plante et son aspect (couleur verte). Ces souches ont été utilisées pour une seconde expérience dans laquelle on a mesuré l'activité de réduction d'acétylène (ARA), la masse de matière sèche totale et la quantité d'azote total des plantes. Les souches qui donnent les meilleurs résultats de fixation d'azote, ORS 1016, ORS 1072 et ORS 1073, appartiennent à Sinorhizobium terangae biovar acaciae (N'Diaye, 1996).

Tableau II – Nodulation d'A. tortilis subsp. raddiana par des souches de collection. (D'après N'Diaye, 1996 ; Bâ, 1996 ; Lortet et al, 1996 ; de Lajudie et al., 1998 a et 1998 b).

16Ces trois souches, une souche isolée de Neptunia natans (ORS 998) et une souche de M. plurifarium (ORS 655) ont ensuite été utilisées pour des essais en pots, en milieu extérieur et conditions semi-contrôlées. Chaque souche a été inoculée à 6 plantes, et, après six mois la quantité d'azote fixé a été estimée : (I) par mesure de la quantité d'azote total des plantes par la méthode de Kjeldahl (Bremner, 1965) ; (2) par mesure de leurs masses de matière sèche. L'analyse statistique montre que dans nos conditions, et sur cette période, on n'observe aucune incidence significative de la souche utilisée sur les paramètres mesurés, et même aucune incidence de l'inoculation, les valeurs obtenues pour le témoin non inoculé, lui-même nodulé par la contamination naturelle extérieure, étant au même niveau (tabl. III). Ces résultats indiquent qu'aucune des souches sélectionnées n'est compétitive vis-à-vis des populations naturelles et/ou plus performante que celles-ci.

Tableau III – Dosage d'azote par la méthode de Kjeldahl (Breainer, 1965) de plants d'Acacia tortilis subsp. raddiana cultivés en pots pendant six mois.

17En conclusion de ces études de nodulation, il faut souligner l'existence d'un groupe de nodulation renfermant A. Senegal, Prosopis juliflora, Leucaena leucocephala et A. tortilis subsp. raddiana nodulés par des souches de diverses positions taxo-nomiques, appartenant à différents genres comme Rhizobium, Sinorhizobium, Mesorhizobium.

Caractérisation des facteurs de nodulation

18Les facteurs Nod sont constitués d'un squelette de 3 à 6 résidus N-acétyl-D glucosamine substitué par une chaîne d'acyl au niveau de l'extrémité non réductrice et portant diverses décorations aux deux extrémités de la chaîne oligo-saccharidique. La nature de l'acide gras et des autres substitutions varie selon la souche ou l'espèce de rhizobia et joue un rôle déterminant dans la spécificité d'hôte de la bactérie. L'addition dans le milieu de culture d'un précurseur radioactif comme l'acide acétique marqué au carbone 14, qui est incorporé dans la molécule au niveau des groupements N-acétyl du squelette de base, permet de marquer radioactivement ces molécules et de les visualiser après séparation en CCM (chromatographie sur couche mince). La migration des produits s'effectue en fonction de leurs propriétés physico-chimiques.

19La plupart des souches sauvages de rhizobia ne produisent pas suffisamment de facteurs Nod pour être détectées en CCM. Il est possible d'augmenter la production de facteurs Nod grâce à l'introduction d'un gène régulateur hétérologue nodù cloné dans un plasmide multicopie (Lerouge et al., 1990 ; Price et al., 1992). Dix-huit souches isolées d'A. tortilis subsp. raddiana représentant les différents groupes électrophorétiques ont été modifiées par l'introduction du gène nodD I de Sinorhizobium sp. NGR234 cloné sur un plasmide multicopie selon la méthode décrite par Lortet et al. (1996).

20À l'exception de la souche ORS 1044, toutes les souches surproductrices construites à partir des souches de A. tortilis subsp. raddiana étudiées présentent des profils chromatographiques très similaires, quelles que soient leur origine géographique et leur position taxonomique (Boivin et al., 1998). La figure 4 illustre ces résultats. L'homogénéité obtenue est supérieure à celle des profils de souches isolées de diverses espèces d'Acacia ou maintenues en laboratoire depuis de nombreuses années. Ces résultats suggèrent que dans des conditions où les bactéries sont en compétition, la plante exerce une pression de sélection en faveur des souches produisant une population de facteurs Nod présentant des particularités structurales bien définies. Ces observations vont dans le même sens que celles de Streeter (résultats non publiés) qui a montré que des souches de Bradyrhizobium japonicum conservées plusieurs années au laboratoire présentent des profils de facteurs Nod différents, alors que des souches fraîchement isolées dans l'Ohio (USA) présentent des facteurs Nod similaires.

21Les facteurs Nod de souches surproductrices dérivées de 4 souches appartenant à différents groupes taxonomiques ont été purifiés par HPLC (High Liquid Chromatography Pressure). Leur structure a été déterminée par LSIMS (Liquid Secondary lon Mass Spectrometry), par GC (Chromatographie en phase gazeuse) et par des méthodes relatives à l'identification des sucres et des lipides (fig. 5 et tabl. IV), confirmant les similitudes observées entre les profils chromatographiques. Toutes les souches produisent des molécules pentamériques dont l'extrémité non réductrice porte un groupement N-méthyl, une chaîne d'acyl en C18:0, C18:1 ou C16:0, et un groupement carbamoyl pour la majorité des souches. L'extrémité réductrice peut être sulfatée ou non.

Tableau IV – Structure chimique des facteurs Nod prépondérants de quelques souches surproductrices isolées de nodules de A. tortilis subsp. raddiana.

Conclusion

22Cette étude constitue une première indication de la forte hétérogénéité taxonomique des souches de rhizobia capables d'induire la formation de nodules sur A. tortilis subsp. raddiana au Sénégal et en Tunisie, deux pays qui représentent le nord et le sud du Sahara. Toutes les souches de collection isolées de diverses espèces végétales ou récemment isolées qui nodulent A. tortilis subsp. raddiana sont des rhizobia à croissance rapide, et parmi elles des souches appartenant à Sinorhizobium (S. terangae biovar acaciae, S. saheli), Rhizobium (R. tropici) et Mesorhizobium (M. plurifarium). L'analyse de 76 nouveaux isolats de nodules d'A. tortilis subsp. raddiana de diverses origines a confirmé la diversité taxonomique des micro-symbiotes de A. tortilis subsp. raddiana dans la nature. Les groupes déterminés par analyse des souches SDS-PAGE sont généralement indépendants de l'origine géographique (nord ou sud du Sahara) de ces souches, des conditions écologiques ou édaphiques locales (sols salés ou non), ainsi que de leur profondeur d'origine. Nos résultats suggèrent que plusieurs groupes mis en évidence parmi les souches d'A. tortilis subsp. raddiana pourraient constituer des espèces génomiques non encore décrites. Il est maintenant nécessaire de valider ces groupes par des techniques complémentaires, en particulier phylogénétiques (séquençage du gène codant pour l'ARN ribosomal I6S, hybridations ADN/ADN), afin de préciser leur position taxonomique exacte et de proposer d'éventuelles conclusions nomenclaturales.

23Par opposition à l'étude taxonomique, l'étude symbiotique a montré une grande homogénéité des caractéristiques symbiotiques des souches isolées d'A. tortilis subsp. raddiana. Toutes les souches étudiées présentent le même spectre d'hôte. Parallèlement leurs facteurs Nod, qui jouent un rôle déterminant dans la spécificité de nodulation, ont des structures similaires. Les facteurs Nod produits par les souches d'A. tortilis subsp. raddiana sont très proches des molécules produites par S. terangae bv acaciae (Lorquin et al., 1997 a) et Rhizobium tropici (Poupot et al., 1993), qui présentent un spectre d'hôte analogue à celui des souches d'A. tortilis subsp. raddiana.

24Cette convergence de différentes espèces bactériennes vers la nodulation des mêmes plantes via les mêmes facteurs Nod a déjà été observée pour les symbiontes de Sesbania (Lorquin et al., 1997 b) et, dans une moindre mesure, pour ceux du soja (voir Denarié et al., 1996). Ces résultats confirment que l'analyse des facteurs Nod pourrait être utilisée pour la caractérisation symbiotique des rhizobia, comme alternative aux tests de nodulation réalisés en laboratoire, ainsi que l'ont proposé Lortet et al. (1996). Cela pose par ailleurs la question plus générale de savoir comment ces bactéries ont traversé l'évolution : leurs propriétés de nodulation résultent-t-elles d'un transfert latéral des mêmes gènes nod chez des bactéries différentes ? ou bien de différents processus génétiques parallèles (mutations, délétions, insertions, etc..) qui, alliés à la pression de sélection de la plante pour le(s) facteur(s) Nod efficace(s), ont abouti à la synthèse des facteurs Nod adéquats ? De façon similaire à ce qui a été fait sur des souches isolées d'Acacia Senegal et de Prosopis chilensis (Haukka et al., 1998), l'étude de la séquence des gènes nod de ces rhizobia et de leur phylogénie pourrait permettre d'apporter des éléments de réponse à ces questions en mettant en évidence la similarité ou la divergence des gènes de nodulation des différents symbiontes d'A. tortilis subsp. raddiana.

Remerciements

25Ce travail a été en partie financé par le Bureau des Ressources Génétiques, le programme Microbiologie AIP Inra, et par la CEE (contrats TS3*CT92-0047, TS3-CT93-0232 et TS3*-CT93-0220).

Auteurs

26P. de Lajudie, B. Dreyfus, C. Boivin

27Laboratoire des symbioses tropicales et méditerranéennes,
UMR 1063 IRD-CIRAD-INRA-ENSAM, Campus de Baillarguet, TA 10/J, 34398 Montpellier Cedex, France

28S. Bâ, A. N'Diaye, J. Lorquin, M. Neyra C. Detrez

29Laboratoire de microbiologie des sols, IRD BP 1386,
Dakar, Sénégal

30A. Willems, M. Gillis

31Laboratorium voor Microbiologie, Universiteit Gent, K.-L. Ledeganckstraat, 35, B-9000 Gent, Belgium

32H. Jeder

33IRA Gabès, Tunisie

34J.-C. Promé

35Institut de pharmacologie et de biologie structurale CNRS, 205, route de Narbonne, 31077 Toulouse, France