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Manuel de sclérochronologie des poissons

 | 
Jacques Panfili
, 
Hélène de Pontual
, 
Hervé Troadec
, 
et al.

Chapitre VIII. Techniques de préparation et d’observation

H.Troadec, H. de Pontual, J. Panfili, W.J. McCurdy, F.J. Meunier, A.J. Geffen et B. Morales-Nin

Texte intégral

1Les chapitres précédents ont montré que les écailles, les otolithes et les os du squelette sont utilisés pour estimer l’âge des poissons en année, en saison ou en jour. La préparation des pc nécessite une série d’étapes de traitement qui peuvent être longues et complexes. Préalablement au démarrage d’une étude de sclérochronologie, il est nécessaire d’identifier les contraintes en termes de temps et de coûts et surtout les objectifs finaux et les résultats attendus (chap. III). Le choix d’une méthode d’estimation de l’âge pour une espèce donnée implique de choisir une pc appropriée (e.g. écaille, otolithe, vertèbre, épine, etc.) et une méthode de préparation pour cette pc (e.g. pc entière, impression, section, lame mince, etc.). Ce chapitre vise à aider le lecteur à choisir l’une des multiples techniques disponibles.

2Quelle que soit l’espèce étudiée, le choix d’une méthode de préparation peut également dépendre de la taille du poisson (e.g. enrobage direct des otolithes de larves) ou du type d’analyse finale à effectuer (e.g. rodage et polissage d’otolithes pour l’étude des microstructures ou techniques d’extraction et de préparation « propres » pour les études de microchimie). Dans ce dernier cas, les techniques de préparation sont principalement guidées par la nécessité de réduire la contamination des échantillons.

3Le but de ce chapitre est donc de guider le choix du lecteur vers une ou plusieurs méthode(s) d’étude en utilisant des arbres d’aide à la décision. Ce choix devrait aboutir au moins à une méthode d’extraction pour une pc donnée, une technique particulière de préparation et, enfin, une méthode d’observation. La sélection de la méthode de préparation comme celle de la technique d’observation devraient aussi tenir compte de la demande croissante de garantie sur la qualité des résultats (assurance qualité et contrôle qualité) (McCurdy et al., 2000), voir également le site Web

4http://www.mar.dfo-mpo.gc.ca/​science/​mfd/​otolith/​english/​quality.htm

A. Arbres d’aide à la décision

H.Troadec, H. de Pontual

5Le but premier de ce sous-chapitre est de fournir au lecteur une vision d’ensemble des procédures d’extraction, de préparation et d’observation décrites par la suite. Il vise aussi à donner au lecteur un accès direct aux procédures de traitement appropriées en fonction de leurs buts et de leurs contraintes. La conception de ces arbres d’aide à la décision a été un exercice complexe. Une représentation exhaustive des différentes manières de traiter chaque pc, pour autant qu’elle eut été possible, aurait généré des arbres gigantesques et inutilisables. Pour cette raison, nous avons choisi de réduire le champ des arbres de décision aux principales procédures de traitement des pc et de cibler en priorité un public d’utilisateurs novices. Ces arbres ont été construits à partir de l’information extraite du présent ouvrage dans lequel ils constituent l’unique lien entre la théorie et la pratique. Sans doute les experts en matière de pc pourront-ils les considérer comme incomplets, trop simplifiés ou même faux puisque nombre de contre-exemples peuvent être aisément trouvés dans la littérature, alors même que les novices pourront rencontrer des difficultés à répondre à certaines des questions posées. Néanmoins, nous espérons que ce sous-chapitre pourra au minimum guider les lecteurs débutants dans leur choix d’une pc, particulièrement dans les cas où la littérature est pauvre, et leur permettre d’accélérer la mise au point d’une procédure de traitement des pc.

6Les arbres se composent de :

  • feuilles représentées par des pavés rectangulaires et correspondant aux procédures décrites dans les sous-chapitres suivants. La version multimédia du manuel possède des liens hypertextes entre chaque feuille et le sous-chapitre correspondant. Les procédures facultatives sont signalées par un texte en italique ;

  • branches de contrôle représentées par les symboles en forme de losange qui contiennent des conditions permettant d’orienter le parcours de l’arbre quand un nœud est atteint. La plupart des conditions se réfèrent aux objectifs de l’étude, mais certaines exigeront qu’une préparation de pc soit faite avant que l’on puisse répondre à une question (e.g. « amélioration nécessaire du contraste des anneaux ? »).

7Le parcours d’un arbre est achevé lorsqu’une feuille terminale est atteinte : le protocole à mettre en œuvre correspond alors à l’ensemble des procédures identifiées pendant le parcours. Lors de la rencontre d’une branche à choix multiple ou d’un nœud contenant une question jugée ambiguë, il convient de se référer à la littérature et/ou à son expérience personnelle afin de comparer les différentes solutions. Si l’on envisage d’introduire une innovation technique (i.e. en modifiant un procédé de préparation ou en utilisant une pc différente), il est conseillé d’évaluer l’avantage relatif fourni par cette amélioration technique par rapport aux possibilités de comparer ses propres résultats à ceux d’études précédentes. Enfin, si l’utilisation de plusieurs techniques d’observation est prévue, il faut s’assurer, avant de commencer le travail, que toutes les procédures de préparation sont compatibles et qu’elles peuvent être combinées correctement aux différentes étapes.

8Le premier arbre de décision se base sur des critères très généraux pour le choix d’une pc appropriée, otolithe, écaille ou tissu osseux. Les trois arbres suivants sont dédiés à chaque type de pc et leurs méthodes de traitement respectives.

B. Extraction et conservation des pièces calcifiées

J. Panfili

9Les étapes d’extraction, de manipulation et de conservation des pc sont primordiales pour le succès des analyses ultérieures (estimation d’âge, analyse microchimique, etc.). Une mauvaise technique de conservation peut entraîner une dégradation irréversible des échantillons.

10Lorsque les pc sont collectées dans le but d’étudier leur composition (microchimie), il devient primordial de réduire au maximum les sources potentielles de contamination. À cet effet, des gants doivent être utilisés pour éviter la contamination par les sels et les graisses de la peau. Les outils métalliques de dissection sont aussi une source de contamination et leur utilisation pour l’extraction nécessite qu’ils soient en matière plastique ou en céramique. Le stockage peut affecter également la composition des otolithes ou celle des autres pc : les échantillons doivent être conservés dans des flacons ou des récipients inertes (et non des enveloppes en papier) et ne doivent pas l’être dans des liquides. L’extraction et la manipulation d’échantillons pour les études de microchimie doivent être réalisées dans des environnements très propres et, si possible, sous une hotte à flux laminaire.

11Tous les plans d’extraction, de préparation et d’observation qui seront décrits dans ce chapitre font référence aux plans d’orientation classiques des organismes symétriques vivants : les plans sagittal, frontal et transversal.

1. Conservation et préservation des poissons entiers

12S’il est nécessaire de conserver le poisson entier, la méthode utilisée influencera également la conservation et l’intégrité de ses pc. Par exemple, la structure de l’otolithe peut être altérée par une technique de conservation inappropriée, car une dégradation post mortem ou une dissolution ultérieure est possible à l’intérieur du labyrinthe de l’oreille interne (Brothers, 1987). Cette remarque est généralisable à l’ensemble des pc internes.

13Il est toujours préférable d’extraire le matériel calcifié à partir de poissons fraîchement tués, et ceci à tous les stades de la vie des individus. Des précautions particulières doivent être prises lors de l’extraction des otolithes chez les larves et les juvéniles car ils sont plus petits et donc plus exposés à une dégradation ultérieure (Brothers, 1987). Si la conservation du poisson entier est nécessaire, elle peut être réalisée (1) par congélation ou (2) dans l’alcool. Plusieurs solutions alcooliques ont été citées dans la littérature mais nous recommandons l’utilisation de l’éthanol à 95 % (il existe toujours un risque de détérioration à une concentration inférieure). Le volume de l’alcool par rapport au volume du poisson doit également être vérifié de façon à éviter une dilution trop importante de la concentration initiale. Il est évident qu’il faut éviter absolument les solutions acides, comme le formol, pour la conservation à cause de la nature minérale des otolithes (carbonate de calcium) ou des autres pc (phosphate de calcium), et donc de la possibilité de destructions secondaires (Williams & Bedford, 1974). Il est préférable d’éviter également le formol tamponné (Brothers, 1987).

2. Écailles

14Les écailles sont certainement les structures les plus simples à extraire. Elles peuvent être prélevées avec soin directement à l’aide de pinces fines, même sur les poissons vivants (fig. VIII.B. 1). La survie des individus après un prélèvement d’écaille ne pose pas de problème particulier car la perte d’écailles est aussi un phénomène naturel. La zone du corps à partir de laquelle le prélèvement est opéré doit être rigoureusement choisie à l’avance et standardisée : la forme des écailles diffère en effet d’une région à une autre pour un même individu. La région choisie varie également d’une espèce à une autre (Werder & Soares, 1984 ; Baglinière & Le Louarn, 1987). La première étape pour une espèce nouvelle doit servir à comparer différents endroits de prélèvement avant de choisir celui pour lequel il existe très peu de variation de la forme des écailles ou encore très peu d’écailles régénérées (Paul, 1968 ; Werder & Soares, 1984 ; Al-Absy & Carlander, 1988). Ces sites d’échantillonnage se situent en général dans la région latéro-dorsale du corps (e.g. sous la nageoire dorsale) ou dans une région où les écailles sont plus protégées (e.g. sous la nageoire pectorale pour certaines espèces). Les régions du corps au niveau desquelles les écailles sont modifiées, comme la zone de la ligne latérale, sont bien sûr à éviter. À chaque fois, plusieurs écailles doivent être prélevées au même endroit dans le but de faciliter les futures comparaisons. Le principal avantage du prélèvement des écailles est que le poisson peut être maintenu en vie lors de l’échantillonnage.

15Après extraction, les écailles doivent être nettoyées. L’opération de nettoyage est relativement simple, allant de la conservation directe après un nettoyage sommaire (e.g. essuyage dans du papier absorbant) jusqu’à l’utilisation de bains à ultrasons. Ces bains peuvent contenir de l’eau distillée, de l’eau du robinet, de la potasse diluée, du peroxyde de sodium ou de la trypsine. La durée de l’immersion dans la solution active doit être contrôlée de façon à éviter une destruction partielle. Les écailles sont généralement conservées à sec dans des pochettes référencées ou des enveloppes. Les tissus de l’écaille sont normalement hydrophiles (collagène) et une conservation à sec va nécessairement déformer la morphologie originelle. Lorsqu’une écaille a été conservée depuis un certain temps et qu’elle doit être observée, il est parfois utile de la réhydrater (e.g. pour les écailles grosses ou épaisses de certaines espèces) : ceci est fait normalement dans de l’eau sans précaution particulière. Les écailles sont aussi très souvent conservées après montage entre deux lames de verre pour préparation microscopique (chap. VIII.C.l).

Figure VIII.B.1
Extraction d’écailles chez un Salmonidae (Salmo trutta), avec l’aide de pinces fines, dans la région médio-dorsale. A, antérieur ; D, dorsal ; P, postérieur ; V, ventral (photo © Ifremer O. Dugornay).

3. Otolithes

16Les otolithes doivent être extraits de préférence sur des poissons venant d’être tués ou venant juste de mourir, ou conservés dans l’alcool ou encore congelés. Il est également possible d’extraire les otolithes sur des poissons cuits, en s’assurant toutefois que la structure et l’intégrité de l’otolithe n’ont pas été altérées pas le processus de cuisson. L’extraction est relativement aisée pour les grands poissons, en fonction de l’espèce et/ou de la taille individuelle, mais elle est plus délicate pour les larves et les juvéniles. Le prélèvement des otolithes sera évidemment facilité si l’anatomie du crâne et de l’appareil vestibulaire sont connus à l’avance. La plupart du temps, seul l’otolithe le plus grand et le plus volumineux est extrait et conservé pour les études ultérieures (la sagitta chez les non-Ostariophyses et l’asteriscus chez les Ostariophyses). La procédure est beaucoup plus complexe lorsque l’on désire prélever tous les otolithes à cause de la très petite taille des 2e et 3e paires : dans ce cas, l’utilisation d’une loupe binoculaire devient obligatoire.

17Dans une synthèse récente sur la description des oreilles internes des poissons cartilagineux, Lychakov et al. (2000) ont souligné le fait que ces poissons ne possèdent pas d’otolithes comme chez les poissons osseux. Le terme « otolithe » est donc réservé uniquement aux Ostéichthyens. Chez les Chondrichthyens, l’âge est estimé à partir des éléments du squelette interne (vertèbres) ou des rayons épineux des nageoires dorsales.

18Lorsque les otolithes sont prélevés pour la première fois chez une espèce donnée, il est particulièrement souhaitable de repérer les différents plans d’orientation du matériel étudié : ceci est primordial pour les étapes suivantes de préparation et pour assurer une description très précise des structures. Les images des otolithes présentées par la suite doivent toutes indiquer les plans d’orientation.

3.1. Extraction chez les poissons de grande taille

19À l’exception des espèces de très petite taille, les otolithes peuvent être extraits à l’œil nu sans avoir recours à un grossissement particulier (e.g. loupe binoculaire). Il existe quatre principales techniques d’extraction, dont le choix dépend essentiellement du plan de coupe du crâne :

  • la section frontale ;

  • la section transversale ;

  • la section sagittale ;

  • la section ventrale par la cavité pharyngienne à travers les branchies.

20Le plan de coupe en section frontale est universel et peut être utilisé avec succès pour tous les types de poissons (quelle que soit l’espèce, la taille individuelle ou encore la morphologie crânienne). Cependant, une méthode donnée est utilisée pour une espèce donnée après une phase d’adaptation et de mise au point technique. Les outils de coupe varient en fonction de la taille du crâne mais vont du simple scalpel pour les plus petits individus jusqu’aux scies électriques pour découper les os crâniens des plus grands poissons (e.g. thons, espadons, marlins), mais un couteau de cuisine est la plupart du temps parfaitement adéquat. La coupe doit être réalisée avec précaution pour éviter de sectionner l’oreille interne et les otolithes. Après avoir effectué la coupe appropriée, les otolithes sont en général prélevés avec des pinces fines. Un prélèvement soigneux et contrôlé peut permettre d’extraire la totalité du système des canaux semi-circulaires de l’oreille, contenant les trois otolithes dont, en général, seul le plus gros est retiré.

3.1.1. Section frontale de la tête (fig. VIII.B.2)

21Une section frontale de la partie supérieure du crâne est pratiquée, en passant généralement à travers la partie dorsale de l’œil, parallèlement à l’axe d’allongement principal du poisson, et terminant au niveau du bord postérieur de l’os operculaire (fig. VIII.B.2a). La partie supérieure décalottée du crâne est enlevée (fig. VIII.B.2b, b’). Le cerveau est alors prélevé délicatement à l’intérieur de la cavité crânienne apparente (fig. VIII.B.2c, c’, d, d’). Les cavités des oreilles internes contenant les canaux semi-circulaires sont ainsi visibles par le dessus : elles sont positionnées à la base du crâne, vers la partie postérieure de la cavité contenant le cerveau et latéralement par rapport à l’axe principal du poisson. Les otolithes sont prélevés à l’aide de pinces fines (fig. VIII.B.2e, e’). Cette méthode est utilisée principalement pour les espèces ayant le corps compressé latéralement (espèces les plus évoluées) et pour les poissons plats.

Figure VIII.B.2. - Prélèvement d’otolithes à partir d’une section frontale de la tête, a, b, c, d, e : Espèce de petite taille (Vinciguerria nimbaria, Photichthyidae, 4 cm LS), a’, b’, c’, d’, e’ : Espèce de taille moyenne (Trisopterus luscus, Gadidae, 25 cm LS), a) Vue latérale de la section frontale avec la lame de scalpel, a’) Vue dorsale de la section frontale avec le couteau de découpe, b, b’) Vues de la section frontale après suppression de la partie dorsale du crâne et des muscles, c, c’) Localisation du cerveau (flèche blanche) avant sa suppression, d, d’) Localisation des otolithes après avoir supprimé le cerveau ; les flèches blanches indiquent la localisation des oreilles internes et les flèches noires montrent les sagittae. e, e’) Extraction de l’otolithe (sagitta) avec des pinces fines ; les flèches blanches indiquent la localisation des cavités de l’oreille interne et les flèches noires montrent les otolithes (sagittae). A, antérieur ; D, dorsal ; Dr, droite ; G, gauche ; P, postérieur ; V, ventral (photos © Ifremer O. Dugornay).

3.1.2. Section transversale de la tête (fig. VIII.B.3)

22Une section transversale de la tête est pratiquée au niveau de la partie postérieure du crâne, en passant généralement à travers la région postérieure de l’os pré-operculaire (fig. VIII.B.3a, a’). La tête entière est coupée et la partie antérieure est séparée du reste du corps. En regardant cette section de la tête par-derrière, la partie postérieure du cerveau (bulbes rachidiens) est alors visible dans la partie supérieure du crâne, et les deux cavités des oreilles internes sont localisées latéralement et sous le cerveau. Normalement, il n’est pas nécessaire d’enlever le cerveau. Les otolithes et les canaux semi-circulaires sont directement prélevés avec des pinces fines (fig. VIII.B.3b, b’, c, c’). Il faut noter que cette méthode demande très souvent un entraînement préalable, en fonction de la morphologie de la tête, de façon à localiser parfaitement le niveau antéro-postérieur de la coupe : il existe en effet un risque non négligeable de couper ou de casser les otolithes. Cette méthode est utilisée principalement pour les espèces de grande taille comme les thons et les espadons, et aussi pour les Anguilliformes.

Figure VIII.B.3 - Prélèvement d’otolithes à partir d’une section transversale de la tête, a, b, c : Espèce de petite taille (Vinciguerria nimbaria, Photichthyidae, 4 cm LS), a’, b’, c’ : Espèce de taille moyenne (Trisopterus luscus, Gadidae, 25 cm LS), a) Vue latérale de la section transversale avec la lame de scalpel, a’) Vue dorsale de la section transversale avec le couteau de découpe, b, b’) Extraction de l’otolithe (sagitta) avec l’aide de pinces fines et après suppression du cerveau, c, c’) Prélèvement des otolithes (sagittae) ; les flèches blanches indiquent la localisation des cavités des oreilles internes ; les flèches noires montrent les otolithes. A, antérieur ; D, dorsal ; Dr, droite ; G, gauche ; P, postérieur ; V, ventral, (photos © Ifremer O. Dugornay).

3.1.3. Section sagittale de la tête (fig. VIII.B.4)

23Une section sagittale de la tête est pratiquée en passant à travers le milieu du crâne (fig. VIII.B.4a, a’), depuis la bouche et au moins jusqu’à la fin de l’os operculaire. À cause de la position latéro-centrale des oreilles internes dans le crâne, la coupe doit être réalisée de façon très précise. Ensuite, une section de la tête dans la région operculaire permet de séparer les deux moitiés. Chaque moitié est alors traitée séparément. Le cerveau est enlevé pour permettre de localiser entièrement l’oreille interne, positionnée à l’arrière et en dessous du cerveau (fig. VIII.B.4b, b’, c, c’). Les otolithes et les canaux semi-circulaires sont alors extraits de l’oreille avec soin (fig. VIII.B.4d, d’). Cette méthode est surtout utilisée pour les espèces possédant un crâne large comme les Siluriformes. Elle permet aussi de prélever plus facilement et à coup sûr les trois paires d’otolithes, car la position anatomique du labyrinthe est mise à jour de façon précise et elle est donc recommandée dans le cas des espèces peu connues.

3.1.4. Section ventrale de la tête à travers les branchies (fig. VIII.B.5)

24Sur la face ventrale, l’opercule est écarté par rapport à la tête du poisson (fig. VIII.B.5a). Les branchies sont alors visibles et les arcs branchiaux sont coupés sur leur bord interne. La structure ventrale des os du neurocrâne apparaît (fig. VIII.B.5b) et tous les tissus environnants doivent ensuite être retirés. Les bulles pré-otiques sont alors localisées dans la partie médio-latérale du neurocrâne. Une légère incision dans la partie externe de ces bulles ouvre l’oreille interne à partir de laquelle le principal otolithe (généralement la sagitta) peut être prélevé (fig. VIII.B.5c). Lors du prélèvement, si la sagitta est poussée malencontreusement à l’intérieur du cerveau, il devient extrêmement difficile de l’extraire sans avoir à couper tous les os crâniens et à supprimer le cerveau entier. Cette méthode convient particulièrement lorsqu’il est nécessaire de conserver l’aspect originel de la tête après la suppression des otolithes, par exemple pour les espèces commercialisées et destinées à la vente. Elle est alors utilisable pour toutes les espèces non-Ostariophyses, donc seulement pour l’extraction des sagittae. D’autres méthodes semi-automatiques de prélèvement des otolithes avec des foreuses ont été mises au point et utilisées sur les marchés de vente de poissons : elles sont maintenant disponibles pour les espèces commercialement importantes comme les Scombridae (Thorogood, 1986).

Figure VIII.B.4 - Prélèvement d’otolithes à partir d’une section sagittale de la tête, a, b, c, d : Espèce de petite taille (Vinciguerria nimbaria, Photichthyidae, 4 cm LS), a’, b’, c’, d’ : Espèce de taille moyenne (Trisopterus luscus, Gadidae, 25 cm LS), a) Vue dorsale de la section sagittale avec la lame de scalpel, a’) Vue médio-dorsale de la section sagittale avec le couteau de découpe, b, b’) Vues de la localisation du cerveau (flèche blanche) dans la demi-tête, c, c’) Suppression du cerveau avec des pinces fines à l’intérieur de chaque demi-tête, d, d’) Extraction d’un otolithe (sagitta) avec des pinces fines ; les flèches blanches indiquent la localisation des cavités de l’oreille interne ; les flèches noires montrent l’otolithe (sagitta). A, antérieur ; D, dorsal ; Dr, droite ; G, gauche ; P, postérieur ; V, ventral (photos © Ifremer O. Dugornay).

Figure VIII.B.5 - Prélèvement d’otolithes à partir d’une section ventrale de la tête à travers les branchies chez Gadus morhua (Gadidae). a) Vue ventrale de l’ouverture de l’opercule et section des arcs branchiaux avec un couteau. b) Vue ventrale de la base du crâne (pointée par la lame de couteau). c) Extraction de l’otolithe (sagitta) après découpe du crâne ; la flèche blanche indique la localisation des cavités de l’oreille interne ; la flèche noire montre l’otolithe (sagitta). A, antérieur ; Dr, droite ; G, gauche ; P, postérieur (photos © Ifremer O. Dugornay).

3.2. Extraction chez les poissons de petite taille (fig. VIII.B.6)

25Cette description concerne toutes les espèces de poissons et les stades de vie dont les tailles n’excèdent pas 2 cm, et donc principalement les larves et/ou les juvéniles. L’extraction doit être réalisée dans un liquide d’immersion ; nous recommandons l’éthanol à 95 % mais certains auteurs utilisent aussi l’eau, la glycérine ou le xylène. L’utilisation de l’éthanol à 95 % empêche une érosion secondaire des structures de l’otolithe. Le prélèvement est normalement réalisé dans le même liquide que celui utilisé pour la conservation des individus entiers.

26Les otolithes peuvent être assez facilement extraits, même chez les plus petites larves, en utilisant un microscope pour la dissection (généralement une loupe binoculaire) avec de la lumière polarisée. Les otolithes ont en effet pour caractéristique d’être réfringents à la lumière polarisée, ce qui permet de les distinguer des tissus avoisinants (fig. VIII.B.6a). Les otolithes sont séparés et prélevés avec l’aide de minuties (e.g. 150 μm de diamètre), en dilacérant les muscles, les os et autres tissus de la tête (fig. VIII.B.6b). Ils sont alors nettoyés des tissus adhérant à leur surface en les frottant et les grattant avec les minuties. La manipulation pendant la dissection nécessite des gestes sûrs et précis, des outils appropriés, de la pratique et de la patience (Secor et al., 1992). L’étape la plus délicate est certainement leur manipulation et leur transport après la dissection. Si les otolithes ne nécessitent pas de préparation supplémentaire, la meilleure technique consiste à les enrober directement dans de la résine (chap. VIII.C.2.2.3). Auparavant, ils sont transportés en les aspirant directement dans une goutte de résine non polymérisée au bout d’une pipette ou d’une fibre de verre. Autrement, les otolithes doivent être manipulés et stockés à sec.

Figure VIII.B.6 - Prélèvement d’otolithes de larves sous une loupe binoculaire en lumière polarisée chez Vinciguerria nimbaria (Photichthyidae). Les otolithes sont facilement localisés grâce à leur réfringence sous la lumière polarisée, a) Vue dorsale de la face antérieure d’une larve ; S, sagitta ; L, lapillus ; échelle = 500 μm (photo J. Tomás), b) Prélèvement d’otolithes avec l’aide de minuties ; les os crâniens et le cerveau sont enlevés avant l’isolement de la sagitta (flèche jaune) et du lapillus (flèche rouge) ; échelle = 1 mm (photo © Ifremer O. Dugornay).

27La même procédure de dissection peut être employée pour prélever les otolithes des embryons dans l’œuf. Dans un premier temps, l’embryon est extrait de l’œuf et les otolithes sont alors enlevés comme décrit précédemment pour les larves.

28Secor et al. (1992) ont décrit deux autres méthodes pour extraire les otolithes de très petite taille, le passage à l’eau de Javel et l’inclusion, mais ces techniques nécessitent beaucoup plus de temps et de pratique, et elles ont finalement moins de réussite : elles ne peuvent être recommandées. Le passage dans l’eau de Javel consiste simplement à immerger le matériel dans de l’hypochlorite de sodium et à extraire les otolithes après la lyse des tissus. D’autres enzymes protéiniques comme la trypsine ont été utilisées (Rojas-Beltran & Vincent, 1993), mais le succès de la procédure d’extraction semble beaucoup plus variable et il est impossible de confirmer qu’il n’y a pas eu d’érosion de la partie protéique de l’otolithe. La technique d’inclusion nécessite au préalable une déshydratation complète de l’individu et ensuite une inclusion dans une résine synthétique (chap. VIII.C.2.2). La manipulation du poisson est alors facilitée et il peut être coupé (par section et/ou ponçage, chap. VIII.C.2.3 et VIII.C.2.5) selon n’importe quel plan et plus particulièrement au niveau des otolithes. Cette dernière méthode est cependant très compliquée à mettre en œuvre et nécessite une très grande habitude de chacune de ses étapes. De plus, en fonction de l’épaisseur des lames de scie servant aux sections par rapport à la taille effective des otolithes, il est souvent très difficile de les atteindre dans la région du cerveau.

3.3. Nettoyage et conservation des otolithes

3.3.1. Nettoyage et manipulation

29Les otolithes doivent être obligatoirement nettoyés avant leur conservation dans le but d’éliminer tous les tissus de la macula et du vestibule adhérant après la dissection. En effet, après séchage, tous les restes de ces tissus empêcheront une observation correcte de l’otolithe entier et/ou une bonne qualité d’inclusion dans un produit synthétique. Le meilleur moyen est de les nettoyer directement pendant ou immédiatement après l’extraction. Un nettoyage mécanique peut être opéré en supprimant les tissus avec des outils comme des pinces fines ou des minuties alors que l’otolithe est encore plongé dans un liquide d’immersion (e.g. eau ou éthanol) (Secor et al., 1992). Les otolithes peuvent être aussi simplement essuyés dans du papier absorbant juste après leur extraction. Une réaction de nettoyage peut être aussi provoquée par immersion dans de l’eau de Javel plus ou moins diluée (10 à 100 % d’hypochlorite de sodium) pendant un temps donné (quelques minutes à plusieurs heures), après quoi il est absolument nécessaire de rincer abondamment le matériel traité plusieurs fois avec de l’eau et/ou de l’éthanol, avant de le sécher.

30La manipulation ne pose pas de problème majeur dans le cas des gros otolithes (> 500 μm) : ils peuvent être manipulés à l’aide de pinces fines et/ou à la main. Les otolithes plus petits (< 500 μm) sont beaucoup plus difficiles à manipuler et, en particulier, ceux des larves qui peuvent avoir des diamètres n’excédant pas quelques microns. Ils sont également extrêmement fragiles et susceptibles de se casser par une simple pression. On peut recommander de tenir compte de leur future utilisation avant d’adopter un protocole donné. Secor et al. (1992) ont décrit quatre techniques pour manipuler et transférer d’un endroit à un autre les très petits otolithes :

  • prélever les otolithes à l’aide d’une micropipette avec une petite quantité du liquide utilisé pour la conservation et la dissection ; transférer ensuite le liquide contenant les otolithes sur une lame propre ou dans un récipient de stockage propre ;

  • pousser les otolithes après dissection dans une zone propre du milieu de dissection et laisser sécher ; après séchage, presser un doigt sur le dessus de l’otolithe et le transférer directement dans le récipient de stockage (l’utilisation d’une loupe binoculaire est parfois nécessaire) ;

  • recueillir l’otolithe sec avec une minutie humectée et le placer directement dans un milieu aqueux ;

  • utiliser un petit pinceau, une anse d’inoculation (loop öse) ou des pinces fines d’entomologiste pour transférer les otolithes.

31La manipulation de très petits otolithes nécessite cependant beaucoup de pratique. Si, après extraction, l’otolithe entier n’a pas besoin d’être examiné sur sa surface, nous recommandons de l’enrober directement dans une résine (chap. VIII.C.2.4.1). L’otolithe peut être aspiré dans une goutte de résine d’enrobage placée à l’extrémité d’une minutie, directement, qu’il soit posé à sec ou immergé au sein du liquide de dissection (e.g. eau ou éthanol) : il n’y a pas de risque de mélange entre la résine et le liquide car la plupart des résines sont hydrophobes. Une fois à l’intérieur de la goutte de résine, l’otolithe est alors placé directement dans une autre goutte elle-même disposée sur une lamelle de microscopie. L’utilisation de ce genre de lamelle permet ensuite d’observer l’otolithe sur ses deux faces (interne et externe) et/ou de le préparer avec une autre technique (e.g. ponçage, polissage).

3.3.2. Stockage et conservation

32La meilleure méthode pour conserver les otolithes est de les stocker complètement à sec. Après nettoyage, ils sont séchés par simple exposition à l’air à température ambiante ou dans une étuve à basse température. Ils peuvent alors être placés dans des microtubes référencés (e.g. Eppendorf®, Treff®). Ces derniers sont, par exemple, préférables aux boîtes de culture tissulaire car ils peuvent être manipulés individuellement ou disposés dans des supports de classement spécifiques. Les microtubes sont aussi suffisamment rigides pour protéger les otolithes des cassures consécutives à leur forme concavo-convexe. Ceci arrive fréquemment lorsqu’ils sont conservés dans des enveloppes comme il avait pu être recommandé auparavant (Williams & Bedford, 1974). Les endroits de stockage frais et obscurs sont probablement les meilleurs et les otolithes séchés peuvent ainsi être conservés indéfiniment (Brothers, 1987).

33Certains auteurs ont également mentionné une conservation dans un milieu comme l’alcool. Ceci peut être particulièrement utile pour les otolithes petits et fragiles. La concentration de l’alcool doit être de 95 % au minimum. Un montage direct dans de la résine a déjà été mentionné précédemment (voir ci-dessus) mais, dans ce cas, il faut contrôler la quantité de résine déposée au-dessus de l’otolithe car, si elle est trop épaisse, elle peut empêcher la mise au point à très fort grossissement (Brothers, 1987).

4. Pièces du squelette

4.1. Extraction

34Toutes les autres pièces squelettiques appartiennent au squelette interne et doivent obligatoirement être extraites par dissection. Il existe cependant une différence notable entre les os « superficiels », comme ceux des nageoires (épines, rayons, operculaires), qui sont extraits facilement et les os « profonds » qui constituent la charpente du corps (vertèbres, cleithrum, etc.). Les outils utilisés pour la coupe varient en fonction de la taille du poisson mais vont du scalpel pour les petits individus jusqu’aux scies électriques pour les plus gros, en passant par les différents types de couteau. Le prélèvement d’un rayon de nageoire commence par la séparation du rayon choisi (généralement le 1er ou le 2e) et des rayons contigus à l’aide d’un couteau (fig. VIII.B.7a) et continue en découpant les muscles à la base du rayon de façon à extraire la Techniques de préparation et d’observation pièce entière (fig. VIII.B.7b). La structure de l’os doit être extraite avec soin de façon à conserver son intégrité pour les futures analyses. Le prélèvement des os internes (e.g. vertèbres) est souvent assez aisé mais la dissection est plus complexe : les muscles, les ligaments et les tissus entourant l’os choisi doivent être retirés en premier (fig. VIII.B.8a), l’os est alors coupé au niveau de ses articulations et toujours extrait intégralement (fig. VIII.B.8b). Si les plans de dissection sont incertains, il est préférable de prélever l’os avec les muscles qui lui sont attachés, même s’il est nécessaire de le nettoyer après.

Figure VIII.B.7 - Prélèvement de rayon de nageoire chez un poisson de grande taille : Thunnus alalunga (Scombridae). a) Vue dorsale du prélèvement du premier rayon de nageoire avec un couteau, b) Une coupe transversale est faite au niveau de la peau avant et après le rayon choisi. Ce dernier est extrait en s’assurant de l’intégrité de la totalité de l’os. A, antérieur ; D, dorsal ; P, postérieur ; V, ventral (photos © Ifremer O. Dugornay).

Figure VIII.B.8 - Prélèvement de vertèbres caudales chez un poisson de grande taille : Thunnus alalunga (Scombridae). a) Section avec l’aide d’un couteau et suppression de la peau et des muscles au-dessus des dernières vertèbres, b) Une coupe est faite entre deux vertèbres et les corps vertébraux (flèches) sont extraits après section des arcs vertébraux. A, antérieur ; D, dorsal ; P, postérieur ; V, ventral (photos © Ifremer O. Dugornay).

4.2. Nettoyage et conservation

35Le nettoyage des pièces du squelette est une étape obligatoire pour une bonne qualité de conservation. Les ligaments et les muscles attachés à l’os sont généralement enlevés à la main, souvent après un passage dans un bain d’eau bouillante, d’eau de Javel diluée, de potasse diluée ou de trypsine. On peut recommander la méthode la plus simple qui utilise le bain dans l’eau bouillante. La durée de l’immersion doit être contrôlée fréquemment pour éviter une surchauffe des tissus des éléments squelettiques ou leur lyse : elle s’étale de quelques minutes pour les plus petites pièces jusqu’à plusieurs heures pour les plus grandes. Le processus de nettoyage doit être contrôlé à intervalles de temps réguliers.

36La conservation est en général très simple et se fait à sec. Pour tous les types d’os, un stockage dans des enveloppes en papier est recommandé car la plupart des os résiste à la dessiccation. Le papier permet, en outre, d’assurer une certaine ventilation des tissus et de recevoir toutes les indications concernant la pc. Les enveloppes sont cependant une source de contamination importante, en particulier si l’on veut effectuer ultérieurement des analyses de microchimie. Un stockage dans des sachets en plastique conduit la plupart du temps à l’apparition de champignons qui peuvent détruire l’os secondairement. Pendant la durée de la conservation, un soin particulier devra être porté pour s’assurer que les tissus ne sont pas attaqués par une faune d’insectes spécialisés : des insecticides et/ou de la naphtaline peuvent être ajoutés dans les enveloppes. Pour les échantillons les plus fragiles, l’alcool peut servir de fixateur, tout en prenant soin de ne pas utiliser des fixateurs acides (Meunier, 1988). Dans ce but, l’éthanol entre 70 et 95 % est préconisé.

C. Préparation des pièces calcifiées

W.J. McCurdy, J. Panfili, F.J. Meunier, A.J. Geffen, H. de Pontual

1. Écailles

37Les écailles n’ont généralement pas besoin d’être préparées pour que leurs marques de croissance puissent être observées. Cependant, comme ce sont des structures hydrophiles, une conservation à sec entraîne parfois une déshydratation et une déformation. Il est alors préférable de les préparer sur un support pour préserver leur forme initiale.

1.1. Observation directe

38Les écailles non montées peuvent être observées directement sous une loupe binoculaire et/ou sous un microscope photonique : elles sont observées soit à sec, soit après immersion dans un bain hydratant et nettoyant (e.g. eau, alcool 70 % à 95 %, eau glycérinée) (chap. VIII.D.1).

1.2. Montage sur lame

39La méthode de montage la plus simple consiste à bloquer les écailles entre deux lames de microscopie (fig. VIII.C.1). Les écailles sont d’abord réhydratées (dans de l’eau ou de l’alcool dilué) et elles sont alors placées directement sur une lame de microscopie référencée (fig. VIII.C.1a). Une deuxième lame est déposée sur le dessus des écailles et fixée à la première grâce à du ruban adhésif (fig. VIII.C.1b). Il est essentiel de vérifier parfaitement le collage des deux lames et de le renforcer si nécessaire avec de l’adhésif. La préparation est alors à la fois utilisable pour observation et prête à être stockée. Si les écailles sont assez larges et épaisses, il est possible qu’une nouvelle déshydratation après montage les déforme à nouveau et exerce une pression sur les lames de verre, pouvant même entraîner leur décollement. Au cours du temps les écailles auront tendance à glisser de leur support. Il est donc nécessaire de vérifier de temps à autre la solidité de la cohésion des lames et de la consolider soit avec du ruban adhésif, soit avec une colle suffisamment souple (e.g. mastic de silicone).

Figure VIII.C.1 - Montage d’écailles entre deux lames, a) Les écailles (flèche rouge) sont positionnées sur la lame référencée (flèche jaune). Il est préférable que les écailles soient humidifiées dans le but de pouvoir les déformer (compresser) plus facilement lors du montage, b) Une deuxième lame (flèche jaune) est déposée sur la précédente et vient comprimer les écailles. Les deux lames (flèches jaunes) sont fixées ensemble en utilisant du ruban adhésif (photos © Ifremer O. Dugornay).

1.3. Impression sur acétate de cellulose

40Une méthode alternative de préparation des écailles consiste à réaliser des empreintes de leur face externe sur des feuilles d’acétate de cellulose (fig. VIII.C.2). Ces dernières sont des feuilles de plastique relativement flexibles qui marquent les empreintes de tout élément rigide qui leur est appliqué en pression. Les écailles sont placées entre deux feuilles d’acétate et l’ensemble est passé dans une presse de joaillier (fig. VIII.C.2a). Les feuilles sont ensuite séparées et les écailles enlevées (fig. VIII.C.2b). La feuille d’acétate, qui était directement en contact avec la face externe des écailles présentant les crêtes des circuli, montre alors leurs empreintes (fig. VIII.C.2b). Cette feuille est donc directement observable sous une loupe binoculaire ou sous un microscope photonique et peut être conservée dans cet état pendant de nombreuses années.

Figure VIII.C.2 - Impression d’écaille sur feuille d’acétate de cellulose, a) Les écailles (flèche rouge) sont positionnées entre 2 feuilles d’acétate (flèches jaunes). L’ensemble est passé entre les deux rouleaux d’une presse (e.g. presse de joaillier), b) La face externe de l’écaille (flèche rouge) est alors séparée de la feuille d’acétate (flèche jaune) et son empreinte reste visible (flèche jaune) (photos © Ifremer O. Dugornay).

2. Autres pièces

2.1. Préparations simples

41Certaines pc, par exemple les os operculaires, peuvent être observées directement dans leur état originel et d’autres, comme les vertèbres, les cleithra ou les otolithes, après seulement un minimum de préparation. Aucune de ces préparations n’implique d’ailleurs un enrobage préalable avant observation. Ces pièces calcifiées sont généralement observées, directement ou après immersion dans un liquide éclaircissant (chap. VIII.D.1), en utilisant un outil de grossissement simple muni d’un éclairage additionnel ou une loupe binoculaire.

2.1.1. Pièce calcifiée entière

42Pour les otolithes peu épais, et plus particulièrement les sagittae des poissons plats et de certaines espèces pélagiques, il est possible de dénombrer les annuli sans avoir recours à une préparation. Les otolithes sont individuellement immergés dans de l’eau, de l’alcool ou dans de l’huile essentielle végétale et observés directement en utilisant une lumière transmise ou réfléchie (chap. VIII.D.1.1.2 et VIII.D.1.1.4). Une large gamme de substances à éclat gras est utilisée pour « éclaircir » la lisibilité ou réduire les reflets de la surface observée des pc. Historiquement, on a pu ainsi utiliser l’huile essentielle de clou de girofle, d’autres huiles essentielles ou les huiles d’immersion. Certaines, comme le créosote, ne sont plus recommandées car elles ont des effets carcinogènes. Les huiles et essences végétales dont les propriétés et les effets ne sont pas connus sont donc déconseillées. L’huile baptisée « baby oil » est souvent prisée des lecteurs d’otolithes. Une source de lumière froide est recommandée pour éviter l’évaporation de l’huile pendant l’observation.

2.1.2. Cassure des otolithes

43Les otolithes peuvent être cassés à la main ou avec l’aide de pinces fines, d’un scalpel ou d’un cutter. Les morceaux cassés peuvent ensuite être fixés sur de la pâte à modeler (e.g. Plasticine™) et badigeonnés avec de l’huile éclaircissante (e.g. baby oil) pour une observation sous une lumière incidente. Ils peuvent également être manipulés dans des cellules d’observation individuelles remplies de liquide éclaircissant (eau, alcool, mélange eau-alcool).

2.1.3. Préparations simples pour les autres pièces

44Certains os, comme les vertèbres, les operculaires ou les cleithra, peuvent être observés sans préparation préalable. Ils sont alors examinés directement ou après immersion dans un liquide éclaircissant, sous une lumière transmise ou réfléchie (chap. VIII.D.1.1.2 et VIII.D.1.1.4). D’autres os, comme les épines et rayons épineux des grands poissons ou les vertèbres, sont simplement sectionnés (chap. VIII.C.2.3) avant observation, sans enrobage préalable. La section ou la tranche est alors directement observée, sèche ou humidifiée, sous une loupe binoculaire.

2.2. Enrobage et imprégnation

2.2.1. Produits d’enrobage

45Tous les produits d’enrobage doivent être conservés dans un endroit sombre et frais, en suivant les instructions fournies par les fabricants. Les résines polyester hautement transparentes ont une durée de vie très courte et doivent être achetées en petite quantité car elles deviennent rapidement opaques en se détériorant. Les principaux produits d’enrobage et leurs applications sont listés dans le tableau VIII.C.1, repris d’après Mosegaard et al. (1998). Les produits d’enrobage les plus utilisés pour des préparations ultérieures sont les résines synthétiques dont le durcissement est irréversible (polyester, époxy, etc.). Il est toujours nécessaire d’utiliser un catalyseur pour démarrer et accélérer leur polymérisation (fig. VIII.C.3) : en fonction de la résine utilisée, le mélange peut être fait en proportion de poids ou de volume. Par exemple, le catalyseur est utilisé à 1-2 % du poids pour la résine polyester (e.g. 25 g de résine polyester pré-accélérée et 0,2 g de catalyseur).

Tableau VIII.C.1 - Produits d’enrobage et de montage standard (d’après Mosegaard et al., 1998).

Produit

Utilisation

Avantages

Désavantages

Résine polyester (RP)

- fixateur permanent de haute qualité
- enrobage et ponçage de surface

- multi-usage
- transparence optique moyenne
- bonnes propriétés pour le ponçage-polissage
- stable à la lumière

- non réversible
- qualité de durcissement variable
- polymérisation lente (12-24 h)
- toxique
- faible retrait
- catalyseur nécessaire

Résine époxy

- fixateur permanent de haute qualité
- enrobage et ponçage de surface

-plus dure que la RP
- transparence optique élevée
- stable à la lumière
- faible contamination chimique
- rétraction minimale
- large gamme d’applications

-non réversible
- polymérisation plus ou moins lente
- toxique
- cher
- catalyseur nécessaire

Colles thermofusibles

- fixateur réversible de haute qualité
- enrobage et ponçage de surface

- prise rapide (en minutes)
- facilement enlevées
- transparence optique élevée
- non toxiques
- bonnes propriétés pour le ponçage-polissage

- chaleur nécessaire (70-160 °C)
- produit des bulles de gaz
- faible retrait
- haute teneur en Si

Super Glue® (cyanoacrylate)

- fixateur très résistant à polymérisation rapide
- ponçage de surface

- facile à utiliser
- durcit sans chaleur ni catalyseur chimique

- haute teneur en S et Pb
- décollement possible de la lame

Colles dentaires UV

-fixateur très résistant à polymérisation rapide
- ponçage de surface

- durcissent sans chaleur ni catalyseur chimique
- non toxiques

-très chères
- transparence optique non connue

Wax

-fixateur temporaire à prise rapide
- enrobage seulement

-rapide
- peu onéreux
- facile à enlever

-souple
- faible qualité optique
- non permanent

Vernis à ongles

- fixateur temporaire à prise rapide
- ponçage de surface

- peu onéreux
- facile à enlever

- souple
- se dissout dans les huiles

Eukitt®

- fixateur souple de bonne qualité
- enrobage seulement

- facile à utiliser
- pas de catalyseur
- bonne transparence optique
- facile à enlever

- durcissement très lent
- reste souple
- peu stable dans le temps
- décollement possible de la lame

Figure VIII.C.3 - Préparation de la résine d’enrobage sous une hotte d’extraction, a) Exemple de mélange en fonction du poids (e.g. résine époxy). Le catalyseur (flèche verte) est ajouté à la résine (flèche rouge) dans un bécher en polypropylène posé directement sur une balance. Le mélange doit ensuite être remué, b) Exemple de mélange direct à partir d’un nombre de gouttes (e.g. résine polyester). Les gouttes de catalyseur (flèche verte) sont ajoutées à la résine (flèche rouge) dans un bécher en polypropylène en fonction du volume de résine. Le mélange doit ensuite être remué (photos © Ifremer O. Dugornay).

46Le tableau VIII.C.2 donne des calculs simplifiés pour les quantités de mélange de résine et de catalyseur, en fonction des proportions désirées. Les résines polyester sont dissoutes dans du styrène et nécessitent toujours l’addition simultanée d’un accélérateur et d’un catalyseur pour polymériser. Comme il existe un risque d’explosion si l’accélérateur non dilué et le catalyseur sont mélangés, les résines polyester sont vendues pré-accélérées pour des raisons de sécurité. Cependant, si le catalyseur est ajouté en excès dans ce type de résine, le risque d’explosion subsiste.

Tableau VIII.C.2 - Dosages simples de la résine polyester (en volume et/ou poids) et du catalyseur (en nombre de gouttes) en fonction de leurs proportions. Plus la quantité de catalyseur est importante et plus la vitesse de polymérisation est élevée. Le préparateur ne doit pas dépasser un seuil de 2 % de catalyseur pour éviter les risques d’explosion.

Tableau VIII.C.2 - Dosages simples de la résine polyester (en volume et/ou poids) et du catalyseur (en nombre de gouttes) en fonction de leurs proportions. Plus la quantité de catalyseur est importante et plus la vitesse de polymérisation est élevée. Le préparateur ne doit pas dépasser un seuil de 2 % de catalyseur pour éviter les risques d’explosion.

47La résine et son catalyseur sont mélangés avec précaution dans le but d’éviter la formation de bulles au sein du mélange, qui pourraient par la suite empêcher une bonne préparation et/ou observation de la pc. Le mélange est ensuite laissé à reposer pendant quelques minutes pour que les plus grosses bulles qui subsistent s’échappent. La durée nécessaire pour le durcissement total varie de quelques secondes (pour une colle cyanoacrylate, une résine dentaire à prise rapide) à quelques heures (pour une résine époxy ou polyester). Nous recommandons l’utilisation d’une étuve pour accomplir parfaitement le processus de polymérisation, après que la résine ait dépassé le stade de gel. Par exemple, la polymérisation complète de la résine polyester est meilleure après une durée minimale de 24 h dans une étuve sèche (à une température d’environ 30 °C).

48La résine peut être colorée par addition d’un pigment, en général noir, ou elle peut être achetée directement pré-colorée. Toutes les résines et leurs catalyseurs, souvent encore appelés « durcisseurs », sont disponibles auprès des revendeurs spécialisés. Des kits de montage contenant de petites quantités de produits, comme de la résine pré-colorée et son durcisseur, sont également disponibles chez certains revendeurs.

2.2.2. Enrobage individuel de pièces pour section ultérieure

49Les pc peuvent être individuellement enrobées avant d’être sectionnées, poncées et/ou polies. Elles sont alors préparées pour leur futur traitement en les enrobant dans de la résine transparente. Les pc doivent être nettoyées et séchées à l’air libre ou dans une étuve avant d’être enrobées.

50L’utilisation de moules individuels est nécessaire pour l’enrobage (fig. VIII.C.4). Ces moules sont en général fabriqués avec une résine d’élastomère de silicone et sont dimensionnés en fonction de la taille des pc. Ils sont souvent référencés individuellement (avec un numéro de référence ou un symbole imprimé sur la base de chacune des cellules du moule). L’élastomère de silicone est un matériau très flexible qui facilite par la suite le démoulage lorsque la résine d’inclusion a polymérisé. Dans un premier temps, une couche de base de résine (e.g. polyester) est déposée dans les différentes cellules du moule avec l’aide d’une pipette en plastique souple et elle est laissée à polymériser. Après un temps suffisant de durcissement (par exemple 4 à 24 h pour le polyester), la pc à inclure est placée sur le fond d’une cellule du moule (fig. VIII.C.4a) et elle est ensuite recouverte par une nouvelle couche de résine d’enrobage (fig. VIII.C.4b, c), en s’assurant que la pc est recouverte complètement par la résine. Lors de cette étape, il est très important de pouvoir retourner la pc dans son moule pour chasser les bulles d’air qui sont souvent piégées en dessous et de la repositionner au cas où elle aurait dévié de sa position originale. Cette phase de positionnement doit prendre en compte les futures manipulations et préparations (par exemple, le positionnement par rapport à un futur plan de coupe). Après environ 20 minutes (ce temps varie cependant avec le type de résine utilisé et l’âge de la résine), la résine catalysée commence à durcir et il sera ensuite impossible d’enlever ou de bouger à nouveau la pc. La durée totale pour une polymérisation complète est comprise entre quelques minutes et quelques heures et, par exemple, il faut prévoir un minimum de 24 h pour la résine polyester (chap. VIII.C.2.2.1). Les pièces enrobées sont alors prêtes à être sectionnées et/ou polies pour les analyses ultérieures (fig. VIII.C.4d).

Figure VIII.C.4 - Exemple d’enrobage : otolithe enrobé à l’intérieur d’un moule en élastomère de silicone. a) Une couche de résine (flèche jaune) a été coulée au préalable dans le fond de chaque moule : après polymérisation, elle devient la base de support pour l’otolithe (flèche rouge). Chaque otolithe est déposé sur le fond de résine durcie. b) L’otolithe est orienté convenablement et il est enrobé dans une deuxième couche de résine qui vient juste d’être préparée (flèche jaune). c) Il faut s’assurer que la résine encore à l’état liquide (flèche jaune) vienne remplir complètement le moule. Sur l’exemple présenté la résine n’atteint pas encore le bord droit du moule. L’otolithe doit alors être retourné pour éliminer les bulles d’air prisonnières. d) Otolithe (flèche rouge) enrobé définitivement dans la résine polymérisée (flèche jaune). Le bloc de résine porte un numéro d’identification (20) moulé en empreinte sur la face inférieure (photos © Ifremer O. Dugornay).

2.2.3. Enrobage pour observation avec une lumière incidente

51Les pièces calcifiées, et principalement les otolithes, peuvent être enrobées dans un produit transparent, classiquement de la résine polyester pour inclusion hautement transparente, sur des supports avec des cavités ou sur des plaques porte-objet en plastique noir. Le fond noir de ces dernières fournit un meilleur contraste pour l’observation des annuli. Cette technique, issue des méthodes décrites en premier par Parrish & Sharman (1959), Raitt (1961) et Watson (1965), est utilisée pour des observations en lumière réfléchie de la face externe des sagittae d’espèces pélagiques (surtout des Clupéidés et Scombridés). Elle convient également pour l’observation en lumière incidente de la surface de petites pc et fournit une méthode de conservation à long terme permettant d’effectuer des relectures à une date ultérieure.

52Des grilles contenant vingt-cinq cavités peu profondes, mesurant chacune environ 7 mm de diamètre et 1,2 mm de profondeur, sont disponibles à cet effet : elles sont usinées dans des plaques en Perspex™ de 3 mm d’épaisseur (dimensions 65 x 60 mm). Chaque plaque possède une bande de 10 mm non usinée, qui permet en outre de la référencer par simple gravure (à l’aide de stylo en métal ou de graveur électrique à pointe de tungstène). Les numéros de référence peuvent être également surlignés avec des crayons gras de couleur (blanc ou jaune).

53Chaque paire d’otolithes doit être correctement positionnée à l’intérieur d’une cavité de la plaque de plastique, i.e. avec le sulcus acusticus (face interne) tourné vers le bas et ainsi non visible (fig. VIII.C.5a). Les petits otolithes, comme ceux du sprat (Sprattus sprattus) (fig. VIII.C.5a), acquièrent souvent une charge électrostatique qui les rend difficiles à positionner. Ces problèmes d’électricité statique peuvent parfois être solutionnés en augmentant le taux d’humidité atmosphérique ou en changeant les vêtements du manipulateur. Une pipette en plastique souple est utilisée pour déposer une goutte de résine mélangée à son catalyseur sur chaque paire d’otolithe, en s’assurant qu’ils sont totalement recouverts (fig. VIII.C.5b). À ce stade, il est très important de repositionner tous les otolithes qui ont pu bouger par rapport à leur position initiale. La résine est ajoutée dans tous les espaces restant vides sur la plaque pour atteindre un niveau unique de résine, recouvrant ainsi la totalité des otolithes de la plaque. Une lamelle de microscopie, de taille adaptée (54 mm x 54 mm x 0,5 mm d’épaisseur), est alors déposée sur la résine (fig. VIII.C.5c) et laissée jusqu’à polymérisation complète sous une hotte aspirante (fig. VIII.C.5d). Cette fine lamelle de verre peut cependant se déformer au niveau de chaque cavité et se fissurer à cause de la rétraction de la résine lors de sa polymérisation. La résine va durcir en quelques heures mais il n’est pas conseillé de commencer les observations avant qu’elle ne soit totalement polymérisée et qu’il n’y ait plus de risque d’absorption de styrène à travers la peau. Les plaques en Perspex™ sont onéreuses et il existe d’autres types de plaque tout aussi adaptés. Des lames de mousse injectée, avec des numéros gravés, sont maintenant disponibles dans le commerce. Lorsque des plaques de plastique usinées sont utilisées, il est nécessaire de s’assurer de la bonne dimension et de la finition de chacune des cavités servant à contenir les otolithes. Si la base de ces dernières est trop abrupte ou si la résine n’adhère pas suffisamment au plastique, des petits paquets de bulles peuvent se former dans la résine lors de la polymérisation : il sera alors très difficile d’observer les pc à l’interface de ces bulles d’air qui auront un effet réfléchissant, comme un miroir.

2.2.4. Enrobage multiple d’otolithes pour section ultérieure

54Les otolithes doivent être enrobés dans un produit de support avant d’être coupés et sectionnés en lame mince : les résines polyester sont fréquemment utilisées comme support (souvent colorées en noir).

Figure VIII.C.5 - Enrobage d’otolithes entiers sur des plaques en plastique noir. a) Positionnement des otolithes dans les cavités des plaques spécialement préparées. b) Remplissage des cavités avec de la résine et son catalyseur. c) Positionnement de la lamelle couvre-objet sur la plaque. d) Vue de la plaque complète terminée (photos R. Rosell).

55Dans ce but, des moules spéciaux, fabriqués en matériau composite souple ou assemblés à partir de blocs en aluminium, peuvent être utilisés (fig. VIII.C.6a). Les moules en aluminium sont normalement utilisés lorsqu’un grand nombre d’otolithes doit être traité, par exemple ceux d’espèces démersales pour la gestion des stocks. Ces moules peuvent être partiellement démontés pour faciliter le démoulage, après polymérisation, des blocs de résine contenant les otolithes. Une variante de cette étape consiste à utiliser un levier d’éjection qui permet un démoulage rapide des blocs de résine sans avoir à démonter les moules (Van Beek et al., 1997). Les moules en aluminium sont toujours pourvus de lignes de guide (rainures) sur les parois latérales ; elles permettent d’aligner les otolithes pour réaliser une coupe à un niveau précis (fig. VIII.C.6a). Un filament de nylon placé dans ces rainures (Bedford, 1983) ou une table de positionnement XY couplée à une caméra vidéo (fig. VIII.C.6b) et un moniteur (Van Beek et al., 1997) sont utilisés pour réduire les effets de parallaxe lors de l’alignement des otolithes dans les moules. Dans le cas de l’assistance vidéo, une ligne traversant le centre du moniteur assure un confort de travail pour l’opérateur qui positionne les otolithes.

56Le principe de préparation pour l’enrobage est le même pour tous les types de moule en aluminium. Le moule est vaporisé ou badigeonné avec un produit lustrant, facilitant le démoulage, avant que la première couche de résine polyester noire soit versée. Une fois que la résine a atteint un état de gel assez solide, les otolithes sont placés et alignés sur cette couche (fig. VIII.C.6c). Une autre couche de résine noire est versée pour recouvrir complètement tous les otolithes et elle est laissée à durcir (les moules peuvent être placés sur une table à niveau pour s’assurer que toutes les couches de résine aient une épaisseur régulière). Les blocs de résine contenant les otolithes sont démoulés lorsque la résine a complètement polymérisé. Il est très important de noter au préalable les références individuelles de tous les otolithes placés dans chacune des parties du moule. Ces informations seront ensuite utilisées pour référencer les coupes terminées contenant les otolithes.

Figure VIII.C.6 - Enrobage d’otolithes en série dans des moules en aluminium. a) Vue des moules en aluminium. b) Système de contrôle d’alignement dans les moules avec l’aide d’un système vidéo (photos Bennett Ltd.). c) Rangées d’otolithes (flèche rouge) déposées sur un fond de résine polyester préalablement colorée en noire et laissée à polymériser. La seconde couche de résine polyester noire (flèche jaune) est versée dans le moule (photo © Ifremer O. Dugornay).

57Une variante consiste à attendre une polymérisation complète de la première couche de résine avant de positionner les otolithes avec une petite quantité de résine non durcie que l’on laisse à polymériser ; on recouvre ensuite complètement les otolithes avec une dernière couche de résine. La première méthode est plus rapide, mais il est important de vérifier que la bonne quantité de catalyseur a été ajoutée à la résine. Si une trop grande quantité de catalyseur est utilisée, la couche de résine ne restera pas au stade de « gel » suffisamment longtemps pour que les otolithes adhèrent complètement à la surface. Cette méthode est également plus subjective car les otolithes concaves doivent être positionnés à l’avance sous le filament de nylon ou grâce au guidage de la caméra, et ensuite retournés (sulcus acusticus vers le haut) pour éviter la formation de bulles d’air.

58Des repères (par exemple, un morceau de spaghetti sec) sont placés sur le côté gauche de chaque moule et sur la première couche de résine à l’état de gel pour indiquer le début de chaque rangée d’otolithes. Un type de moule possède un bord biseauté sur le côté gauche qui fait office de repère (Van Beek et al., 1997).

59D’autres procédures utilisent d’autres types de résine, comme celle qui est employée avec de la fibre de verre (« lay-up ») dans la fabrication des bateaux (Bedford, 1983). Une autre méthode d’inclusion utilise un mélange de résine pour fibre de verre et de résine d’inclusion plus souple (« flex ») pour la première couche au fond du moule, puis un mélange de résine du type « gel-coat » et de résine « flex » pour la deuxième couche. La résine du type « gel-coat » est utilisée en général pour la fabrication des coques de bateau et assure une surface de contact parfaitement lisse. Du talc en poudre ou un produit similaire peut être utilisé pour sécher la surface dans le cas où la couche supérieure est constituée de résine pour fibre de verre (McCurdy, 1985). L’ajout de petites quantités de résine de type « flex » (tab. VIII.C.3) permet de s’assurer que les blocs sont assez souples une fois terminés (ils peuvent être légèrement cintrés) : cela supprime le risque que les otolithes se brisent sous l’action de la scie à vitesse rapide lorsqu’ils sont découpés. Si des petits otolithes doivent être inclus, l’ajout au mélange de résines d’un peu de poudre de craie empêche la lame diamantée de la scie de s’encrasser avec de la résine et améliore la vitesse de la coupe.

Tableau VIII.C.3 - Table de mélanges de la résine polyester utilisée pour la préparation de type « Otolin ».

Tableau VIII.C.3 - Table de mélanges de la résine polyester utilisée pour la préparation de type « Otolin ».

2.2.5. Imprégnation des tissus osseux

60La plupart des os sont constitués de tissu osseux vascularisé et, lorsque les trabécules osseux sont relativement fins et entourés de grandes cavités, la pièce entière est relativement fragile. Pour cette raison, il est nécessaire de consolider les structures osseuses pour éviter une cassure ou une rupture pendant la découpe. L’inclusion doit alors suivre un processus précis d’imprégnation avec de la résine polyester, de façon à s’assurer que cette résine pénètre bien dans toutes les cavités de l’os et qu’elle polymérise de la même façon que la résine entourant l’os. Ce processus d’imprégnation est décrit ci-après pour de la résine polyester (stratyl).

61La pc, i.e. un os, est déshydratée dans des bains successifs d’alcool à 70 %, 95 % et 100 %, en utilisant au moins un bain de 24 h pour chacune des concentrations. Deux bains de chaque concentration sont préconisés pour les pièces les plus larges. La pc est ensuite immergée dans deux bains successifs d’acétone d’une durée de 24 à 48 h avant d’être finalement placée dans le solvant du monomère (styrène) puis dans le monomère de la résine (i.e. résine sans catalyseur) pendant 24 h. En fonction du type de polyester utilisé, des bains supplémentaires peuvent être nécessaires avant l’étape d’inclusion. Pour cette dernière étape, la pc est immergée dans de la résine pré-polymérisée (monomère + catalyseur à 1-2 %) dans un moule (en élastomère souple) contenant déjà un fond de base polymérisé. Il est souvent recommandé de placer le moule avec la résine et la pc pendant quelques minutes dans une chambre à vide de façon à supprimer les dernières bulles d’air et à améliorer l’imprégnation. Lorsque le bloc a polymérisé et durci (par exemple, pour le stratyl après 1 à 2 jours dans une pièce à température ambiante et une semaine dans une étuve à 60° C), il peut être sectionné avec une scie rotative à vitesse lente (chap. VIII.C.2.3.1).

2.3. Section

62La section des pièces est souvent une étape préliminaire à de nombreuses autres voies de préparation, comme l’attaque acide, la coloration et la préparation de lames minces, mais elle est aussi souvent nécessaire pour révéler les structures internes des pc. Par exemple, lorsque les sagittae sont extrêmement opaques ou trop épaisses pour que leurs marques de croissance soient clairement identifiables par transparence, l’observation de sections transversales minces, passant à travers le noyau, améliore significativement la lisibilité de ces marques. Il n’existe pas de méthode standard universelle pour sectionner les pc, et les procédures ainsi que le matériel utilisé pour fabriquer des coupes simples et/ou fines varient en fonction de la nature de l’application souhaitée (Mosegaard et al., 1998).

2.3.1. Section de pièces individuelles (fig. VIII.C.7)

63Le principal problème lorsque l’on effectue une section est de s’assurer qu’elle inclut le meilleur plan de coupe (e.g. le centre de la pc, etc.) (chap. III.C). La coupe est réalisée par simple ponçage (chap. VIII.C.2.5) ou, le plus souvent, avec l’aide d’une scie à vitesse lente ou rapide. L’une des scies les plus fréquemment employées est la scie rotative à vitesse lente Isomet® (Buehler Ltd) équipée d’un disque diamanté. Toutes les scies de ce type utilisent différents liquides de coupe : nous recommandons l’eau pour les structures pratiquement hydrophobes comme les otolithes et l’alcool dilué (70 à 95 %) pour les tissus hydrophiles comme les os. En fonction d’une évaporation possible, la quantité d’alcool utilisée doit être vérifiée fréquemment. La préparation et la section d’une pc durent en général de une à cinq minutes.

64Une pc est généralement enrobée (chap. VIII.C.2.2) avant d’être coupée : elle est ainsi plus facilement manipulable. Ceci devient indispensable dans le cas de pc de petite taille comme certains otolithes. Le niveau de section, ajusté à l’aide d’un micromètre présent sur la scie, doit être fixé en premier (fig. VIII.C.7a), en traçant un repère sur la résine avec un stylo indélébile ou un outil tranchant. Si deux niveaux de section sont nécessaires pour la suite des opérations, e.g. dans le cas de la préparation de lames minces, ils doivent être tracés en premier (fig. VIII.C.7a). Lorsque qu’une coupe très précise doit être réalisée (par exemple pour les très petits otolithes), l’épaisseur de l’outil de coupe doit être prise en compte : un disque diamanté classique a une épaisseur d’environ 300 μm. Avec une scie Isomet® classique, l’échantillon est coupé simplement en exerçant une pression sur le disque diamanté en rotation (fig. VIII.C.7b, c). Certaines pc assez larges, comme les épines (épines de poissons-chats, par exemple), peuvent être coupées sans avoir recours à une inclusion dans de la résine (fig. VIII.C.7d).

Figure VIII.C.7 - Section des pièces calcifiées : exemples de coupe d’un otolithe enrobé dans de la résine et de coupe d’une épine dorsale entière dans le but d’obtenir des tranches. a) Localisation des niveaux de coupe (flèches rouges) pour obtenir une tranche d’otolithe contenant le noyau. b) Découpe à l’aide d’une scie rotative à vitesse lente (Isomet®, Buehler Ltd). Le bloc de résine contenant l’otolithe (flèche rouge) est coupé par un disque diamanté (flèche jaune) en rotation (flèche bleue). Le disque est humidifié en permanence. c) Détail de la figure précédente. Le disque diamanté (flèche jaune) tourne pendant que le bloc de résine est appuyé directement dessus en pression. Le niveau de section est indiqué par les flèches rouges. d) Section d’une tranche dans une épine dorsale entière. Le courant d’eau est visible à l’interface entre l’épine (flèche rouge) et le disque diamanté (flèche jaune) (photos © Ifremer O. Dugornay).

65Des doubles sections peuvent être parfois opérées avec les scies rotatives à vitesse lente en utilisant une paire de lames séparées par un espace correspondant approximativement à l’épaisseur de coupe désirée. Cette dernière peut varier de 150 à 500 pm, en fonction des marques de croissance qui doivent être mises en évidence.

2.3.2. Section multiple (fig. VIII.C.8)

66Même si les scies à vitesse lente ont pu être utilisées pour réaliser des sections multiples d’otolithes enrobés dans des blocs de résine polyester (McCurdy, 1985), les scies à vitesse rapide sont beaucoup plus efficaces pour ce type d’opération et lorsqu’il est nécessaire de préparer un grand nombre d’otolithes. Ces scies à vitesse rapide sont habituellement adaptées à partir de machines du type fraiseuse (Bedford, 1983) ou de machines de précision de géologie pour les coupes ou le ponçage (Van Beek et al., 1997). Des scies spécialement destinées aux otolithes sont également disponibles. Le choix d’une scie à vitesse rapide dépend à la fois de la quantité d’otolithes à traiter et du budget disponible pour l’achat de ce genre d’équipement. La nécessité ou non d’étapes complémentaires dans la préparation des otolithes doit aussi être prise en considération.

67Les sections multiples transversales sont préparées en routine, pour les sagittae des espèces démersales, dans les laboratoires fournissant des données d’âge individuel pour la gestion des stocks. Dans les laboratoires européens, la technique décrite par Williams & Bedford (1974) et ses variantes ont tendance à être privilégiées : elles produisent des tranches fines de résine polyester contenant les otolithes (fig. VIII.C.8a-c). Par ailleurs, les variantes de la méthode de Nichy (1977), donnant également des tranches transversales d’otolithes, sont utilisées en routine pour la gestion des stocks. Le système Otolin développé par Van Beek et al. (1997) a été la première étape de développement d’un prototype de production en ligne de coupes d’otolithes, pour effectuer des lectures d’âge en routine pour les espèces démersales.

Figure VIII.C.8 - Section d’otolithes en série avec une scie diamantée (flèche jaune) à grande vitesse. a) La première section traverse les otolithes. Le niveau de section a été localisé au préalable directement sur la résine colorée en noir. b) La deuxième section permet d’obtenir la tranche contenant les otolithes (flèche rouge). Le courant d’eau (flèche bleue) arrive directement sur le disque diamanté (flèche jaune). c) Résultat final de la lame contenant les otolithes en série (photos © Ifremer O. Dugornay). (d) Vue de la scie diamantée à grande vitesse du système Otolin (photo Bennett Ltd.).

68Un certain nombre de variations de la méthode de Bedford ont pu être mises au point (tab. VIII.C.4). Certaines d’entre elles n’affectent pas la lisibilité des marques de croissance des otolithes (par rapport à leur vitesse de coupe et au nombre de coupes effectuées), mais des variations dans l’épaisseur des coupes peuvent affecter cette lisibilité. Toutes les lames de scies circulaires travaillent avec une épaisseur de coupe minimale et font perdre une certaine quantité de matériel lors de la coupe à cause de la lame : il est nécessaire de tenir compte de la perte de ce matériel. Les facteurs qui influencent cette perte sont l’épaisseur de la lame elle-même et la grosseur des grains de diamant qui la composent. En essayant d’obtenir de très fines sections, on peut aboutir à une fragilisation ou à une cassure des coupes réalisées. Ceci est particulièrement évident dans le cas de l’utilisation de deux lames juxtaposées pour réaliser directement des doubles sections : des lames plus fines permettent d’optimiser l’épaisseur de la coupe désirée. Pour tous les types de scie, la section doit être suffisamment épaisse pour que la résine soutienne les otolithes pendant la découpe, mais aussi suffisamment fine pour que le niveau de transparence permette d’observer les marques de croissance.

Tableau VIII.C.4 - Préparations des lames minces d’otolithes utilisées pour l’estimation de l’âge de Merlangus merlangius L. dans différents instituts de recherche européens (ices, 1998).

Tableau VIII.C.4 - Préparations des lames minces d’otolithes utilisées pour l’estimation de l’âge de Merlangus merlangius L. dans différents instituts de recherche européens (ices, 1998).

2.3.3. Section au cryotome (Fig. VIII.C.9)

69L’utilisation de l’hématoxyline d’Ehrlich pour colorer les os impose de travailler sur du matériel décalcifié (chap. VIII.C.2.6.2). Les sections sont alors réalisées sur du matériel congelé, avec un cryotome, par exemple le modèle Cryomat™ de chez Leica Ltd (un microtome avec à la fois la lame et la platine réfrigérées). Les os décalcifiés sont congelés soit dans de la glace asséchée, soit directement sur le porte-échantillon réfrigéré au méthanol du Cryomat™. Les échantillons congelés sont coupés par la lame du microtome (fig. VIII.C.9a) et les coupes sont récupérées dans une boîte de Pétri remplie d’eau distillée (fig. III.C.9b). Ces coupes font environ 15-20 μm d’épaisseur, en fonction du matériel traité. Elles peuvent alors être conservées dans de l’alcool 70 % avant d’être colorées (chap. VIII.C.2.8.2).

Figure VIII.C.9 - Section d’épine avec l’aide d’un cryotome. a) Une épine décalcifiée (flèche rouge) est enrobée dans de la glace (flèche blanche). La lame du cryotome (flèche jaune) se déplace vers l’avant (flèche rose) et vient couper de très fines tranches de l’épine congelée (flèche rouge sur la lame). b) Les coupes minces (flèche rouge), encore enrobées de glace (flèche blanche), sont déposées à la surface de l’eau (flèche bleue). Après décongélation, les coupes flottent à la surface (flèche rouge) et peuvent ainsi être récupérées (photos © Ifremer O. Dugornay).

2.4. Montage

2.4.1. Montage des sections préalable aux étapes suivantes des préparations (fig. VIII.C.10)

70Quand des lames minces transversales d’otolithes (ou d’autres structures calcifiées) doivent être préparées, la coupe épaisse avec le noyau de l’otolithe est collée sur une lame de verre avec une colle thermoplastique (e.g. Crystal BondTM) avant d’être poncée puis polie (fig. VIII.C.10a, b). Le bloc peut être retourné, puis à nouveau fixé sur une lame par sa face polie, pour poncer puis polir ensuite la deuxième face (fig. VIII.C.10c, d).

2.4.2. Montage des otolithes de petits poissons (fig. VIII.C.11a)

71Les petits otolithes sont souvent montés directement dans le produit d’inclusion (chap. VIII.C.2.2.1). Après extraction, l’otolithe est plongé dans une goutte du produit d’inclusion et posé directement sur une lamelle. On peut utiliser une résine polyester qui permet la manipulation de l’otolithe avant la polymérisation. L’otolithe ainsi monté peut être observé directement quelques heures seulement après sa préparation et conservé tel quel pendant une longue période. La précaution la plus importante est de contrôler l’épaisseur de résine au-dessus de l’otolithe, car la distance frontale de l’objectif du microscope peut être très faible aux forts grossissements. Il est souvent nécessaire d’enlever une certaine quantité du produit d’inclusion avant l’observation : un excès de résine peut être retiré de la lamelle avec un simple scalpel ; dans d’autres cas, il sera nécessaire de poncer et/ou de polir la pièce avant l’observation.

Figure VIII.C.10 - Montage de préparation : exemple de collage d’une tranche d’otolithe avec de la colle thermofusible et retournement sur une plaque chauffante. a) Collage de l’otolithe avec la colle thermofusible (e.g. Crystal Bond™). Le bloc contenant la tranche (flèche rouge) est amené (flèche grise) sur la colle thermofusible encore à l’état visqueux (flèche jaune). b) La tranche est poussée en pression (flèche grise) sur la colle (flèche jaune). Cette pression chasse les bulles d’air captives dans la colle sous la préparation. La tranche d’otolithe (flèche rouge) est en fait collée (flèche jaune) sur un morceau de lame de verre lui-même collé sur une lame de microscopie (flèches vertes). c) Vue de la préparation terminée et enlevée de la plaque chauffante. d) Retournement du bloc de résine. Lorsque la colle thermofusible est suffisamment liquide à haute température (flèche jaune), la tranche est retirée, retournée (flèche grise), et re-déposée sur la colle sur le morceau de lame de verre (flèche verte). La préparation alors terminée est retirée de la plaque chauffante (photos © Ifremer O. Dugornay).

2.4.3. Montage sur lame de plusieurs coupes d’otolithes

72La lame de résine noire contenant les coupes transversales passant par le centre de croissance des otolithes (fig. VIII.C.8c) est fixée sur une lame porte-objet (76mm x 50mm) de microscope, recouverte par une résine pré-polymérisée (i.e. avec catalyseur) et protégée par une lamelle de verre. Le numéro d’identification de chaque section est gravé sur chaque lame de microscopie.

73Une pipette jetable en plastique souple est utilisée pour déposer la résine de montage sur la lame de microscopie, ce qui permet ainsi de coller les coupes sur la lame de verre. La résine peut alors polymériser. De la résine pré-polymérisée est déposée sur la lame de verre dans les espaces, entre et sur les coupes, pour former une couche uniforme au-dessus de la lame. Il est nécessaire d’agiter doucement le mélange pour éviter la formation de bulles dans la résine qui gêneraient l’observation des annuli sur les otolithes. Après environ 20 minutes, la résine commence sa polymérisation et une lamelle est délicatement posée pardessus. La préparation est placée sous une hotte jusqu’à complète polymérisation de la résine. L’excès de résine sur la préparation microscopique peut être retiré avec un scalpel dès que la résine a la consistance d’un gel et toute trace de résine peut être enlevée à l’aide d’un morceau de papier absorbant imbibé d’une goutte d’acétone.

74Les sections d’os coloré (par exemple des sections d’épines colorées à l’hématoxyline) sont montées sur des lames histologiques dans un milieu hydrophile (Permount®, Aquamount®) et recouvertes d’une lamelle (fig. VIII.C.11b).

Figure VIII.C.11 - Exemple de montage de pièces calcifiées. a) Enrobage d’otolithes de larve dans de la résine. Les otolithes (flèches rouges) sont déposés à l’aide d’une minutie (flèche verte) dans une goutte de résine polyester (flèches jaunes) sur une lamelle de microscopie. Chaque otolithe a été lui-même transporté dans une goutte de résine positionnée au bout de la minutie. L’image de droite est une vue grossie de l’opération. Échelle = 1 mm. b) Enrobage d’une coupe fine et colorée d’épine dans de la résine. La coupe (flèche rouge) est déposée dans une résine hydrophile (flèches jaunes) en utilisant des minuties (photos © Ifremer O. Dugornay).

2.5. Ponçage progressif et polissage (fig. VIII.C.12)

75Il n’y a pas une grande différence de sens entre « ponçage » et « polissage ». Ce dernier terme correspond mieux à la dernière étape du procédé de ponçage-polissage. Les pièces calcifiées peuvent être poncées directement ou après un enrobage, ou encore à partir d’une section.

76Comme pour les coupes, le ponçage d’une pc est fait pour : (1) améliorer sa lisibilité, (2) distinguer les marques qui ne sont pas visibles sur la pc entière, (3) effectuer une étape préalable à diverses autres techniques de préparation (e.g. brûlage, coloration, MEB, empreinte d’acétate, microradiographie). Comme pour les coupes, le procédé de ponçage progressif nécessite une orientation soignée du plan de coupe de la pc (transversal, sagittal ou frontal).

77Les étapes de ponçage et de polissage sont souvent réalisées à la main à l’aide de papiers abrasifs mouillables, avec ou sans pâte abrasive. Le ponçage utilise des papiers abrasifs à l’eau, de grain compris entre 120 et 1200. Le polissage utilise des tissus avec différentes grosseurs de poudre d’alumine (de 3 μm à 1/3 μm) ou des poudres de diamant. Lors des préparations manuelles, les mouvements d’usure ou de polissage doivent être faits sans direction définie de façon à éviter des distorsions systématiques du plan de la préparation et à conserver une épaisseur régulière de l’objet à observer (fig. VIII.C.12).

Figure VIII.C.12 - Ponçage et polissage des préparations. a) Ponçage. La préparation, une tranche d’otolithe montée sur une lame de microscopie (flèches rouges), est poncée à la main sur un papier abrasif à l’eau (flèches jaunes). Le mouvement de la main est irrégulier (flèches grises doubles) pour éviter un rodage unidirectionnel et des rayures systématiques. b) Polissage. La préparation, une tranche d’otolithe montée sur une lame de microscopie (flèches rouges), est polie sur un disque de feutre (flèches jaunes) avec de la poudre d’alumine (poudre blanche) et de l’eau. Le mouvement de la main est irrégulier (flèches grises doubles) pour éviter un polissage unidirectionnel et des rayures systématiques (photos © Ifremer O. Dugornay).

78Des machines spéciales (rodeuses et polisseuses) peuvent être utilisées à la fois pour des préparations d’otolithes en série et pour des applications spécifiques pour lesquelles un état parfait de la surface (surface parfaitement plane sans aucun relief) doit être obtenu comme, par exemple, pour les coupes fines nécessaires à des analyses microchimiques (tout particulièrement avec des outils analytiques comme les wds, eds ou pixe). Certaines machines permettent de spécifier la quantité de matériel à enlever (par exemple l’épaisseur finale des sections). L’abrasif est un carbure de silicium (SiC) en poudre. Il est utilisé pour :

  • user les lames de verre de façon à standardiser leur épaisseur et pour obtenir une surface dépolie qui augmente l’adhérence de la résine quand les otolithes sont montés sur les lames ;

  • poncer les préparations pour enlever le maximum d’épaisseur de la résine recouvrant les otolithes enrobés.

79Après ponçage, les lames ou les préparations sont soigneusement nettoyées dans un bain à ultrasons (un bain d’eau Milli Q est nécessaire pour la microchimie). Les préparations sont alors traitées avec une polisseuse automatique en plusieurs étapes :

  • ponçage fin ou pré-polissage à l’aide de papiers abrasifs au carbure de silicium de grain décroissant (grain de 800 à 1200), avec de l’eau comme lubrifiant (eau Milli Q pour la microchimie) et avec un contrôle optique permanent du plan à atteindre ;

  • polissage pour enlever les rayures et les irrégularités introduites par les étapes préalables du ponçage. Il est réalisé progressivement à l’aide de différentes suspensions de pâtes diamantées (ou de sprays) en milieu aqueux (e.g. grains décroissants de 9 μm - 3 μm - 1 μm - 0,25 μm). Le choix des étapes terminales du polissage dépend de la qualité requise (voir plus haut). Le polissage se fait sur des tissus dont les caractéristiques dépendent de la taille des grains de la poudre de diamant.

80Pendant le polissage, les préparations sont régulièrement contrôlées au microscope en lumière réfléchie, car c’est le seul moyen de vérifier la bonne qualité de la surface (fissures, rayures, etc.). Pour faciliter cette procédure, des porte-objets en Plexiglass® peuvent être utilisés d’autant plus qu’ils sont avantageux en termes de risque de contamination, notamment pour les analyses microchimiques.

2.6. Attaque acide, décalcification

2.6.1. Attaque acide de l’otolithe

81L’action de l’acide sur l’otolithe entier ou sur une section est une destruction superficielle d’une partie du calcium minéral. Plusieurs acides dilués ont été proposés dans la littérature : acide nitrique à la concentration de 0,2 N (Albrechtsen, 1968) ; acide chlorhydrique à une concentration comprise entre 0,1 et 1 % (nombreux auteurs) ; acide acétique à 1 % (Richter & McDermott, 1990) ; acide éthylène diamine tétra-acétique (edta) à 5 % (nombreux auteurs). L’edta semble préférable car l’attaque de la surface est ménagée et la dégradation de l’otolithe est moins rapide qu’avec les autres agents réactifs (Campana & Neilson, 1985). La durée d’action de l’acide est très variable et dépend des espèces et de la taille de l’otolithe : quelques minutes sont suffisantes pour obtenir de bonnes préparations mais un test préliminaire doit être fait pour chaque type de matériel.

82Après l’attaque acide, la préparation doit être rincée plusieurs minutes dans de l’eau distillée. Elle est ensuite séchée avant les étapes suivantes du traitement (coloration, meb).

2.6.2. Décalcification des tissus osseux

83La préparation des coupes à la congélation, pour la coloration à l’hématoxyline (chap. VIII.C.2.8.2), nécessite une décalcification préalable des os. Pour les études squelettochronologiques, l’agent décalcifiant usuel est l’acide nitrique à la concentration de 5-10 %, selon le volume de l’échantillon. La durée de la décalcification varie aussi en fonction du volume et du degré de minéralisation de l’os. Dans certains cas, le processus de décalcification doit être strictement contrôlé car, lorsque l’os est totalement débarrassé de sa composante minérale, la trame collagénique peut être attaquée rapidement par l’acide et devenir particulièrement fragile à la coupe, d’une part, les marques de croissance ne pouvant plus être distinguées par la coloration, d’autre part.

84La décalcification est stoppée par un lavage de plusieurs heures à l’eau du robinet. Les échantillons sont alors conservés, éventuellement plusieurs jours, dans l’alcool 70 % avant de procéder aux coupes. L’étape de la coupe est toujours précédée par un lavage soigné (12 à 24 h) dans l’eau courante pour enlever toute trace d’acide nitrique qui pourrait perturber le bon contraste de la coloration.

2.7. Chauffage et brûlage (fig. VIII.C.13)

85Dans certains cas (par exemple pour les poissons plats), la qualité des observations peut être améliorée par un chauffage de l’otolithe jusqu’à la dénaturation des protéines qui prennent une couleur brune, rendant ainsi les zones de croissance hivernales (translucides) mieux visibles.

Figure VIII.C.13 - Brûlage et cassure d’otolithe. a) L’otolithe est placé directement dans une flamme avec l’aide de pinces fines. b) La partie protéique de l’otolithe brûle au bout de quelques instants. La durée du brûlage est variable en fonction de l’espèce considérée et de la taille de l’otolithe. L’otolithe doit acquérir une couleur brune. c) L’otolithe brûlé est ôté de la flamme et il est cassé par le milieu sur un support rigide avec l’aide d’une lame de scalpel (photos © Ifremer O. Dugornay).

86Le brûlage est pratiqué de quelques secondes à quelques minutes, selon l’espèce et la taille de l’otolithe. Après cette opération, l’otolithe est délicatement cassé à l’aide d’une lame de scalpel ou d’un autre outil dur (fig. VIII.C.13c). Plusieurs méthodes de brûlage ont été testées au laboratoire du National Marine Fisheries Service de Wood’s Hole, mais finalement seuls les otolithes de la morue (Gadus morhua) sont chauffés dans un four irradiant à 275 °C pendant trois à six minutes (Almeida & Sheehan, 1997). Dans certains cas, les otolithes cassés ou les otolithes qui ont été coupés en deux avec une scie diamantée sont brûlés pour augmenter le contraste et donc la lisibilité des annuli. La stabilité des surfaces brûlées peut être conservée en incluant les otolithes ainsi préparés dans des moules en polyéthylène remplis d’une résine parfaitement transparente.

2.8. Coloration (fig. VIII.C.14)

2.8.1. Coloration des otolithes (fig. VIII.C. 14a-b)

87La coloration est une méthode de préparation qui révèle de fines lignes d’accroissement chromophiles, comparables, quelques fois, à celles obtenues après brûlage. Développée pour la première fois par Albrechtsen (1968), cette technique consiste, après section, polissage et attaque ménagée de la surface à l’acide, à placer celle-ci au contact d’un colorant histologique. Le colorant utilisé par Albrechtsen était le violet de méthyle (à 15 %), un colorant spécifique des noyaux cellulaires, mais toute une série d’autres colorants peuvent également être utilisés. D’après Richter & McDermott (1990), qui ont testé plusieurs colorants, ce sont le bleu d’aniline à 1 % (aussi appelé « bleu brillant ») et le bleu de toluidine (1 %) qui donnent les meilleurs résultats. En histologie classique, ces deux produits colorent respectivement le collagène, le cartilage et les noyaux cellulaires en bleu. En revanche, les propriétés spécifiques de ces colorants dans l’otolithe ne sont pas très bien connues, puisqu’il ne contient ni collagène, ni noyaux cellulaires. Il est possible que ces colorants soient attirés par des protéines spécifiques de la composante organique des otolithes. Gauldie (1990) a suggéré que ces colorants agissent physiquement en se localisant dans les discontinuités mises en évidence par l’attaque acide de surface plutôt que par une réaction chimique sélective avec les protéines. Quoi qu’il en soit, nous recommandons l’utilisation du bleu de toluidine à 1 % pendant quelques minutes, après attaque acide superficielle, comme colorant universel des otolithes.

88Bouain & Siau (1988) ont proposé une autre méthode de coloration après fracture préalable de l’otolithe : immersion pendant 12-14 h dans la fuchsine acide, puis passage pendant plusieurs minutes dans du noir solide à 5 % ; les accroissements apparaissent alors bleu foncé sur un fond rose. Il semble qu’une action physique de cette coloration ne soit pas complètement exclue. Une autre méthode de traitement consiste à passer l’otolithe dans un bain d’acide et à le colorer avant d’effectuer les sections (Richter & McDermott, 1990), mais cette technique est peu utilisée.

89Comme dans l’attaque acide ménagée, le temps d’action du colorant est très variable, dépendant des espèces et de la taille des otolithes : quelques minutes sont suffisantes pour obtenir de bonnes préparations, mais des essais préliminaires sont nécessaires dans chaque cas. Après coloration, la préparation doit être soigneusement rincée à l’eau claire pendant quelques secondes pour protéger la coloration.

2.8.2. Coloration des tissus osseux (fig. VIII.C.14c)

90Le colorant spécifique pour les marques de croissance des os est l’hématoxyline qui colore les lignes cimentantes à cause de leur richesse en protéoglycans. Cette technique est tout à fait favorable pour la détection des lac.

91Avant la coloration, les sections d’os décalcifiées sont réhydratées si nécessaire, prélevées avec l’extrémité d’un pinceau fin, essorées et plongées dans une goutte d’hématoxyline. Après 10 à 12 minutes (le temps nécessaire varie avec le matériel à colorer et avec la qualité de l’hématoxyline), les sections sont récupérées et rincées à l’eau du robinet jusqu’à ce que la coloration vire au bleu. Les lac et les lignes cimentantes de réversion apparaissent en bleu foncé à violet sur un fond bleu clair à mauve clair. Les sections sont alors délicatement prélevées avec un pinceau pour être montées dans une résine hydrophile (Aquamount®) (chap. VIII.C.2.4.3 et fig. VIII.C.11b).

Figure VIII.C.14 - Coloration. a) b) Coloration d’otolithe. Une coupe transversale d’un otolithe enrobé dans de la résine et attaqué à l’acide (flèche rouge) est colorée par dépôt d’une solution de bleu de toluidine. La préparation doit ensuite être abondamment rincée pendant quelques temps avec de l’eau distillée. c) Coloration de coupes d’épine décalcifiée. Les coupes d’épine, flottant dans de l’eau distillée, sont recouvertes d’une solution colorante (hématoxyline d’Ehrlich). La préparation doit ensuite être abondamment rincée pendant plusieurs minutes avec de l’eau distillée (photos © Ifremer O. Dugornay).

92L’hématoxyline d’Ehrlich (Ganter & Jolies, 1969) est préparée de la façon suivante :

- hématoxyline

4 g

- éthanol 95 %

200 ml

- eau distillée

200 ml

- glycérol

200 ml

- alun de potassium

6 g

- acide acétique

20 ml

93Il faut dissoudre l’hématoxyline dans l’éthanol, puis ajouter les autres produits, et laisser le mélange vieillir doucement à l’air et à la lumière, au moins deux semaines à la température du laboratoire. L’hématoxyline d’Ehrlich se garde pendant plusieurs années.

94Remarque : Plus la solution colorante est vieille, meilleure est la qualité de l’hématoxyline d’Ehrlich. C’est pour cette raison que l’on a tout intérêt à conserver, en permanence, un flacon d’hématoxyline d’Ehrlich mais il est indispensable, alors, de filtrer la solution régulièrement ou, tout au moins, juste avant l’emploi pour éviter les précipités sur la préparation.

2.9. Quelques considérations particulières pour les études de microchimie

95La microchimie est l’analyse de la composition des pièces calcifiées. Dans la plupart des cas, les techniques de préparation des échantillons sont les mêmes que celles utilisées pour l’observation des accroissements. Cependant, il existe toujours un risque de contaminer les échantillons pendant la manipulation et le traitement, et certaines des techniques analytiques présentent, en outre, des contraintes spécifiques concernant la qualité de la surface des préparations. Pour réduire les difficultés analytiques, plusieurs considérations dans le choix du matériel et des techniques de préparation des échantillons devraient être prises en compte.

96Une directive générale concerne le matériel utilisé pour la manipulation et le stockage : il doit être chimiquement inerte, nettoyé avec de l’acide HNO3 ultra-pur dilué et rincé avec de l’eau ultra-pure (18-MΩ).

97Les techniques de surface mesurent la composition chimique ponctuellement à la surface d’échantillons préparés en coupe. Les pc sont enrobées dans de la résine et sectionnées avec une scie ou par ponçage. La résine doit être soigneusement choisie en considérant les deux aspects suivants :

  • la pureté de la résine. Il est essentiel que la résine utilisée soit inerte de sorte qu’elle n’introduise aucune contamination pendant l’imprégnation. La plupart des résines époxy ne contiennent pas, en concentration détectable, les éléments habituellement recherchés dans les otolithes. En revanche, les colles à base de cyanoacrylate et les résines thermofusibles peuvent contenir des teneurs élevées en S, Si, et parfois Pb. Les résines polyester devraient également être évitées parce qu’elles peuvent contenir des contaminants susceptibles d’affecter la mesure de la composition des otolithes ;

  • la viscosité de la résine. Lors de l’analyse des échantillons par la technique icp-ms à ablation laser (la-icp-ms), l’énergie du laser peut être très destructive. Si l’échantillon est tenu de manière trop lâche dans la résine, l’énergie peut le faire vibrer, se briser et l’éjecter hors de la résine. Les résines à faible viscosité telles que la Spurr ou l’araldite sont les plus appropriées pour les préparations en microchimie. Il est particulièrement important de s’assurer de la pureté des résines à faible viscosité, précisément du fait de leur capacité à s’infiltrer dans l’échantillon.

98Les réactifs et les matériaux de ponçage et de polissage doivent être choisis afin de réduire le risque de contamination. Les consommables utilisés pour la microchimie peuvent être, en conséquence, différents de ceux utilisés pour les études classiques d’observation. Les disques abrasifs et les poudres d’alumine (AlO2) sont une source évidente de contamination par les métaux. L’utilisation de sprays ou de suspensions diamantées en phase aqueuse est donc recommandée. Les liquides de lubrification utilisés avec les scies (l’eau Milli Q est recommandée) et lors du polissage peuvent constituer des sources moins évidentes de contamination.

99Quelques techniques analytiques (eds, wds, pixe) requièrent l’obtention d’une surface finale de préparation parfaitement polie avec une très bonne planéité, conditions difficiles à obtenir par un polissage manuel. Un ponçage et un polissage automatiques sont recommandés (chap. VIII.C.2.5). Des contrôles relatifs à la progression de la préparation (plan de coupe et état de surface) doivent être fréquemment réalisés au microscope en lumière réfléchie.

100Le nettoyage final avec de l’eau Milli Q dans un bain à ultrasons a été souvent suggéré dans les protocoles de préparation.

101Il est également important que les récipients servant à conserver les préparations soient exempts de contaminants. Certaines méthodes analytiques étant très sensibles à l’humidité, il convient de stocker les préparations dans une armoire à dessiccation jusqu’à l’analyse. Divers procédés de décontamination ont été suggérés avant l’analyse des échantillons :

  • pré-ablation quand les préparations sont analysées avec la technique la-icp-ms (Campana et al., 1995) ;

  • nettoyage de la préparation avec un tissu imbibé de HNO3 ultra-pur pendant 15 secondes (Milton et al., 1997). Ce procédé n’est pas recommandé quand la technique analytique est sensible à la rugosité de la surface de la préparation.

102En microchimie, les analyses globales permettent d’obtenir des mesures de composition à partir d’échantillons de pc dissous. L’échantillon est habituellement dissous dans un acide et introduit dans l’instrument de mesure sous forme liquide.

103Les manipulations entraînent toujours un risque de contamination des échantillons. En conséquence, les étapes d’extraction, de nettoyage et de séchage des préparations pour l’analyse globale devraient être effectuées en conditions propres, sous une hotte à flux laminaire classe 100. La pesée des échantillons doit être soigneuse et précise. Du fait que les résultats des analyses globales sont généralement exprimés relativement à la quantité de matériel analysé, l’incertitude liée à la pesée peut en affecter la fiabilité.

104La pureté de l’acide utilisé pour la digestion est extrêmement importante pour éviter la contamination des échantillons et, également, parce que des impuretés présentes dans l’acide utilisé pour fabriquer les blancs et les standard entraîneront l’obtention de moins bonnes limites de détection (lods) et donc une diminution de la sensibilité. L’utilisation d’acide nitrique re-distillé (sub-boiling) dilué avec de l’eau ultra-pure est recommandée. Diverses méthodes sont employées pour dissoudre les échantillons de pc pour l’analyse globale. La plupart d’entre elles utilisent l’acide nitrique du fait de son excellent pouvoir d’attaque du CaCO3. L’échantillon peut être dissous à la température ambiante mais la digestion peut être alors incomplète. Dans le cas des otolithes, la digestion à température ambiante peut laisser un « fantôme » résiduel composé de protéines qui résistent à la digestion acide. La digestion à chaud dans l’acide nitrique permet une décomposition complète de la matrice protéique mais entraîne des manipulations supplémentaires qui risquent d’engendrer une contamination des échantillons. Pour obtenir une digestion complète, le chauffage de l’échantillon dans l’acide effectué dans un four à micro-ondes peut être un bon compromis. Dans les études de microchimie, il est important de prendre la matrice protéique en considération parce qu’il existe très peu d’informations relatives aux éléments associés aux protéines (par rapport à la composante minéralisée). Alors qu’il pourrait paraître souhaitable de développer un protocole de digestion qui laisse intacte la matrice protéique, il est, en pratique, probablement préférable d’obtenir une digestion complète de l’échantillon pour éviter l’introduction d’une variabilité associée à une destruction partielle des protéines. Campana et al. (2000) ont rapporté le résultat d’une expérience de décontamination comparant les résultats de cinq protocoles de préparation. Des quatre éléments examinés (Mg, Ba, Li et Sr), Mg est le seul qui ait présenté des différences significatives de concentration en fonction du traitement appliqué.

D. Observation

B. Morales-Nin, J. Panfili

105Il existe pratiquement autant de techniques d’observation des pc que de techniques de préparation, allant des plus simples jusqu’aux plus complexes. Le chercheur devra donc en sélectionner une parmi toute cette gamme en fonction de l’aptitude de la technique à répondre aux objectifs de l’étude. Comme pour le choix d’une technique de préparation, le choix d’une méthode d’observation dépend du temps requis et disponible pour obtenir les résultats escomptés, mais aussi des coûts expérimentaux. Par exemple, la standardisation des conditions d’éclairage des échantillons devient obligatoire pour l’utilisation de l’analyse d’images (Mosegaard et al., 1998) : une description précise de ces conditions est absolument indispensable lorsque l’on désire par la suite comparer les propriétés optiques des pc. Les marques de croissance peuvent être révélées de façon variable en fonction de la source de lumière utilisée.

106Dans ce chapitre, nous présentons quelques-unes des techniques d’observation les plus couramment employées dans le cadre des études de sclérochronologie.

1. Microscopie photonique

1.1. Faible grossissement (loupe binoculaire)

107Les grandes pièces du squelette, comme les cleithra des Esocidae, peuvent être observées et mesurées sans avoir recours à un quelconque grossissement. L’âge peut être estimé à l’œil nu, même sur le terrain, et pour des individus ayant jusqu’à 30 ans (Casselman, 1974). Cependant, les marques de croissance sont rarement assez larges pour être observées avec exactitude à l’œil nu et il est assez fréquent de les regarder à un faible grossissement. À cette échelle, seules les marques saisonnières et annuelles sont visibles. Cette méthode d’observation est certainement la moins coûteuse et la plus rapide, permettant en outre d’observer un grand nombre d’échantillons dans un minimum de temps. La gamme habituelle de grossissements s’étend de 1X à environ 100X.

1.1.1. Pièce entière

108L’observation de la pc entière est particulièrement adaptée pour les structures relativement fines et translucides comme les écailles, les os operculaires, les cleithra et certains otolithes. Pour les poissons possédant des pc épaisses qui sont trop denses pour que les marques de croissance les plus internes soient visualisées, il est nécessaire de les préparer en coupes (chap. VIII.C.2.3).

1.1.2. Milieu éclaircissant

109L’utilisation d’un milieu éclaircissant est recommandée pour tous les types d’observation, avec ou sans préparation préalable des pc. Un tel milieu est un liquide ou un produit durcissant (résine) qui permet d’améliorer le contraste et la visualisation des marques de croissance. Il possède souvent la même densité optique que celle de la pc, ou une densité proche, permettant ainsi à la lumière de pénétrer plus facilement, dans le but de révéler les structures les plus internes. Plusieurs liquides éclaircissants sont disponibles : le plus fréquemment utilisé est probablement l’eau, puis viennent les solutions salines (plus isotoniques), suivies par l’alcool, les mélanges eau-alcool (à différentes proportions), la glycérine, le mélange glycérine-alcool (30 :70) et les huiles d’immersion. Les huiles essentielles (clou de girofle, romarin, pin, cèdre, camomille, etc.) offrent également de très bons résultats. D’autres liquides, comme le créosote, le xylène, le benzoate de méthyl, sont désormais moins utilisés car ils s’avèrent dangereux pour la santé. De plus, une attention particulière doit être portée, au préalable, pour s’assurer que les marques de croissance ne sont pas endommagées et/ou rendues illisibles par un effet secondaire de ces liquides. Après une observation dans un liquide visqueux et/ou gras, la pc doit être nettoyée avec un tissu imprégné d’une solution d’éther-alcool (50 :50). Pour les otolithes par exemple, le choix d’un liquide éclaircissant dépend de l’espèce considérée : pour les otolithes petits et/ou fins, l’eau ou le sérum physiologique peut être recommandé tandis que, pour les otolithes plus épais, les huiles sont préconisées (e.g. huile essentielle de romarin). La plupart des produits de fixation (e.g. résine) améliore en général la lisibilité des pc.

1.1.3. Produits de montage

110Le terme « produit de montage » regroupe tous les produits qui permettent simplement de fixer la pc, la plupart du temps sur une lame de microscopie (Secor et al., 1992). En outre, certains de ces produits permettent à la fois de conserver les préparations des pc et d’améliorer la lisibilité de leurs marques de croissance. Ils agissent également à travers leurs propriétés de densité optique. Ces produits sont la plupart du temps des résines synthétiques : polyester, Protexx®, Flotexx®, colle cyanoacrylate, colle thermofusible, Permount®, etc. Des problèmes liés à certains produits de montage spécifiques peuvent cependant survenir ultérieurement, à cause de leur opacité et de leur couleur, de leur dureté et/ou de leur faible qualité après une longue conservation : c’est le cas par exemple pour l’Eukitt®, le cyanoacrylate, le baume du Canada et l’époxy. Les produits permanents irréversibles peuvent limiter la manipulation ultérieure des pc si un autre type d’observation est requis : c’est le cas par exemple du montage des otolithes de poissons pélagiques dans de la résine polyester sur des lames Perspex® en plastique noir. Nous recommandons de monter les pc plus hydrophobes avec de la colle thermofusible à basse température (40-60° C) ou avec de la résine polyester, et les pc hydrophiles (e.g. coupes fines d’épines) avec du Permount®.

1.1.4. Éclairage

111Deux voies peuvent être employées pour éclairer les surfaces à observer. La lumière passe soit directement à travers la PC (lumière transmise) ou elle est projetée sur la surface par le dessus (lumière réfléchie). La lumière réfléchie est souvent utilisée pour observer les marques de croissance saisonnières tandis que, pour l’observation des microstructures (e.g. journalières) des otolithes, la lumière transmise est préférée. Quoi qu’il en soit, des essais préalables de comparaison des sources de lumière, transmise et réfléchie, doivent être effectués avant d’utiliser l’une ou l’autre en routine pour lire les marques de croissance saisonnières (e.g. pour les os). L’aspect de ces accroissements saisonniers va dépendre du type d’éclairage employé (fig. VIII.D.1) : sous une lumière transmise, les marques translucides sont lumineuses et les marques opaques sont sombres tandis que, sous une lumière réfléchie, les marques translucides sont sombres et les opaques lumineuses. Le fait que les marques de croissance soient décrites comme « lumineuses » ou « sombres », en fonction du type d’éclairage, peut conduire à une certaine confusion et, pour cette raison, les termes « opaque » et « translucide » devraient toujours être utilisés (Casselman, 1974, 1983 ; Williams & Bedford, 1974).

1.1.4.1. Lumière transmise (fig. VIII.D.1a, b)

112Avec une lumière transmise, il est nécessaire d’employer un récipient transparent si la pc observée doit être immergée dans un liquide éclaircissant. Deux types d’éclairage sont également disponibles et doivent être testés : un éclairage transmis direct (fig. VIII.D.1a) ou un éclairage en diascopie (fig. VIII.D.1b). Lorsque des coupes épaisses de pc sont observées, la meilleure image est obtenue lorsque la base de la pc est illuminée par le côté avec un éclairage à fibres optiques et que la surface est cachée de la lumière. L’ombre en surface oblige la lumière à passer par le niveau inférieur de la coupe et à ressortir sous la surface observée, augmentant de la sorte le contraste entre les zones opaques et translucides. La luminosité et le contraste à la surface d’une pc peuvent être contrôlés en faisant varier la position des fibres optiques (Estep et al., 1995).

1.1.4.2. Lumière réfléchie (fig. VIII.D.1c)

113La qualité de l’observation est améliorée en utilisant un récipient possédant un fond noir. La source de lumière incidente doit être soit latérale, soit en provenance du dessus de la préparation examinée. L’utilisation d’une lumière réfléchie nécessite l’emploi d’un milieu éclaircissant pour éviter une distorsion de la lumière en surface. Une bonne orientation de la source lumineuse est particulièrement importante et doit être réglée pour obtenir le meilleur contraste entre les marques de croissance. Il est toutefois préférable d’utiliser une source de lumière froide pour les observations en lumière incidente afin de minimiser l’évaporation du liquide éclaircissant : les fibres optiques sur support souple couplées à une lampe de forte puissance sont certainement le meilleur moyen.

Figure VIII.D.1 - De gauche à droite, otolithe entier de Pleuronectes platessa, coupe d’épine de Pangassius hypophthalmus et écaille de Dicentrarchus labrax, observés en lumière transmise directe (a), en lumière transmise en diascopie (b) et en lumière réfléchie sur fond noir (c). Échelle = 200 μm (photos J. Panfili).

1.1.4.3. Projecteur de profil

114Le projecteur de profil est surtout utilisé pour la lecture des écailles. Au début des années vingt, le projecteur de profil a été développé pour projeter des images grossies des écailles sur un verre dépoli. Ceci a ensuite été copié dans de nombreux laboratoires et était disponible dans le commerce (Carlander, 1987). Ce genre d’appareil permet d’effectuer des mesures manuelles des distances sur le verre dépoli. De nos jours, les systèmes informatiques d’analyse d’images sont employés dans le même but dans les laboratoires à haute technologie les plus récents mais avec de meilleures performances et un plus grand rendement.

1.2. Fort grossissement (microscope photonique)

115Le fort grossissement au microscope photonique est utilisé principalement pour examiner les microstructures des otolithes, pour interpréter les micro-accroissements primaires et, quelques fois, pour observer la structure interne des autres pc (e.g. constituants cellulaires et extracellulaires des os). Comme pour la loupe binoculaire, différentes sources de lumière peuvent être employées : même si la lumière transmise est la plus couramment utilisée, d’autres types d’éclairage existent, comme la lumière réfléchie, la lumière polarisée, le contraste de phase et la fluorescence. À ce niveau, l’observateur doit faire un choix après des essais comparatifs de ces différents éclairages. Les observations microstructurales sont meilleures avec un microscope photonique doté d’un équipement minimal (Campana, 1992) : deux oculaires dont l’un au moins est réglable à la vue, des objectifs avec des grossissements de 20x, 40x et 100x (plus d’autres, par exemple 10x et 60x), une platine de déplacement d’objets (ou mieux une platine motorisée déplacée à l’aide d’un joystick), un condensateur de lumière, un diaphragme d’ouverture et un variateur d’intensité lumineuse avec son propre condensateur. Un microscope avec des caractéristiques inférieures peut induire un biais pour l’interprétation des micro-accroissements. La visualisation des images peut être facilitée par l’utilisation d’une caméra vidéo liée à un moniteur.

1.2.1. Résolution

116La limite de résolution correspond à la plus petite distance séparant deux structures contiguës visibles. La résolution en microscopie photonique dépend principalement du matériel et, plus particulièrement, des objectifs disponibles. Les lentilles corrigées pour les aberrations chromatiques et sphériques, et possédant de faibles ouvertures numériques sont plus indiquées. Campana (1992) donne un tableau intéressant qui illustre les limites des caractéristiques des principaux types d’objectif : l’ouverture numérique de l’objectif contrôle finalement à la fois le grossissement et la résolution obtenus, et cette dernière augmente lorsque l’ouverture diminue. Cependant, la limite de résolution réelle d’un microscope photonique parfaitement au point est inférieure à la limite théorique (autour de 0,3 μm) et empêche souvent, de ce fait, l’observation des plus petites structures, i.e. les micro-accroissements des otolithes inférieurs à 1 μm (Campana, 1987 ; Morales-Nin, 1988 ; Campana, 1992). Dans ce cas, l’utilisation du MEB devient obligatoire. Les possibilités de grossissement sont limitées par le matériel disponible. L’objectif maximal qui peut être utilisé est normalement 100x (avec ou sans huile d’immersion) et, avec une bonne combinaison d’oculaires et de bagues intermédiaires, le grossissement maximal utile atteint 1000x-1250x (Campana, 1992).

1.2.2. Objectifs à immersion vs objectifs à sec

117Les objectifs de faible puissance sont des objectifs à sec (jusqu’à 60x) tandis que les objectifs à immersion sont utilisés pour les forts grossissements. En biologie, la plupart des utilisateurs pensent que le grossissement maximal peut être seulement obtenu avec un objectif à immersion de 100x. Cependant, il existe des objectifs à sec 100x qui sont utilisés en géologie et qui sont donc particulièrement appropriés pour les études de sclérochronologie. L’un de leurs principaux avantages est de pouvoir préserver l’état original de la préparation de la pc (e.g. lames minces) car il n’est pas nécessaire de la nettoyer à la suite de l’observation. Lorsque l’on utilise des objectifs à immersion et de l’huile d’immersion, la préparation doit ensuite être nettoyée avec une solution d’éther-alcool (50 :50). Nous recommandons donc dans l’absolu l’utilisation d’objectifs à sec, quel que soit le type de grossissement employé.

1.2.3. Éclairage

118Une source d’éclairage optimisée a une influence très importante sur la qualité de l’image visualisée (Campana, 1992), quels que soient les oculaires et les objectifs employés. Toutes les étapes de mise au point de l’éclairage en microscopie photonique sont identiques à chaque fois : elles incluent le centrage de la source lumineuse, la focalisation de la lumière sur le plan d’observation avec le condensateur, et l’ajustement des diaphragmes de champ et d’ouverture. Un diaphragme d’ouverture ajusté correctement va augmenter les contrastes, la profondeur de champ et la résolution. Tous ces paramètres doivent être vérifiés au début de l’examen d’une série d’échantillons, mais les mêmes paramètres doivent être utilisés entre les différentes séries d’échantillons dans le but de standardiser le processus.

1.2.3.1. Filtres

119Les lentilles achromatiques tendent à améliorer la qualité des images lorsque le diaphragme d’ouverture est fermé et lorsqu’une lumière monochromatique est utilisée. Le changement de la qualité d’une image peut être attribué au fait que les lentilles ne sont pas totalement corrigées pour toutes les longueurs d’onde de la lumière artificielle ou pour la totalité du champ de vision. La lumière verte est la plus fréquemment utilisée. Un filtre de couleur faisant écran à la source de lumière peut augmenter la limite de résolution de 15 à 20 % (Campana, 1992). Les filtres de polarisation améliorent l’observation des marques de croissance et sont aussi recommandés (chap. VIII.D.1.3).

1.2.3.2. Microscopie confocale

120La microscopie confocale, également appelée microscopie laser à balayage (mlb), permet l’observation de sections confocales (simple plan focal d’épaisseur avoisinant 0,5 μm) dans les couches internes d’échantillons épais. Cette technique est utilisée pour examiner la morphologie des pc, principalement des otolithes, et les micro-accroissements chez les larves et les juvéniles, dans le but d’évaluer la croissance et le choix d’un plan de coupe (Lagardère et al., 1995). Comparée à la microscopie photonique conventionnelle, les avantages de la mlb incluent simultanément les mesures en 3D et l’augmentation du contraste et du niveau de résolution pour certaines applications. La mlb peut opérer en mode d’épi-illumination (confocale) et en mode de transmission. Les observations faites en mode épi-illuminé dépendent de l’autofluorescence de l’otolithe. Cette technique peut aussi être utilisée pour détecter les marques de fluorescence sous la surface d’un otolithe. Cette technique confocale ne peut cependant pas permettre de délimiter le dépôt des marques de croissance dans les otolithes car elle dépend de la fluorescence des spécimens étudiés. L’examen des micro-accroissements des otolithes en MLB nécessite l’utilisation d’un mode transmis.

1.2.3.3. Lumière transmise vs lumière réfléchie

121En microscopie photonique, il existe deux possibilités d’éclairage : la plus fréquemment utilisée est la lumière transmise, qui permet une observation à travers une faible profondeur de champ, et la moins utilisée est la lumière réfléchie (également appelée épi-réfléchie), qui ne permet que l’observation de surface. Ce dernier type d’éclairage a été développé à l’origine pour les études de géologie et nécessite un équipement spécial sur un microscope standard. Ceci permet au faisceau de lumière de passer à travers les lentilles des objectifs, de se réfléchir sur la surface et de retraverser les lentilles pour générer une image. Cette technique est particulièrement utile pour observer les surfaces après des préparations spéciales, comme le ponçage et/ou le polissage, de façon à contrôler leur qualité. Une application possible est le contrôle de l’attaque acide des surfaces des pc avant un passage au meb. Néanmoins, le contrôle de cette attaque acide peut être fait directement sous le microscope (chap. VIII.C.2.6). Il est également possible de combiner les deux sources de lumière, transmise et réfléchie, lorsque cela est nécessaire.

1.3. Lumière polarisée

122La lumière polarisée est obtenue au moyen de deux filtres de polarisation et de lumière transmise. Le premier filtre (le polariseur) est placé entre la source de lumière et la préparation, et le deuxième (l’analyseur) entre la préparation et les oculaires. La position relative de ces deux filtres peut être ajustée et offre la possibilité de déceler les différents états de polarisation de la lumière à travers la pc préparée. Ceci peut révéler certaines structures qui ne sont pas visibles sous une lumière normale. Les otolithes ou les os ont eux-mêmes des propriétés de polarisation. Les otolithes sont réfringents à la lumière polarisée et cette caractéristique permet de les visualiser même chez les très petits individus, comme les larves de quelques millimètres de longueur (chap. VIII.B.3.2). La lumière polarisée est nécessaire pour observer certaines marques de croissance des otolithes, et particulièrement les microstructures situées près du bord (Mosegaard et al., 1998). Pour l’examen structural des os, la lumière polarisée est utile pour révéler l’orientation des fibres de collagène, par exemple : la matrice osseuse à fibres enchevêtrées ou la matrice osseuse à fibres parallèles ou, encore, l’os lamellaire (Francillon-Vieillot et al., 1990) (chap. II.C.1.1.2).

1.4. Lumière ultraviolette

123La lumière ultraviolette (uv) est seulement utilisée pour révéler les marques de fluorescences incorporées dans les pc (chap. IV.A.1.2.1). L’équipement nécessaire à la production de lumière uv est en général spécialement adapté pour les microscopes photoniques, ce qui malheureusement limite son utilisation à l’observation de petites préparations. Le chemin emprunté par le faisceau de lumière est le même que celui de la lumière réfléchie (chap. VIII.D.1.2.3.3), arrivant par le dessus et passant à travers l’objectif. Le nom de « lumière épifluorescente » est aussi donné à ce type d’éclairage. L’utilisateur doit vérifier la compatibilité de la source d’uv et des objectifs du microscope. En fonction de la substance fluorescente révélée, des filtres spécifiques peuvent être nécessaires. Le tableau IV.A.1 résume les caractéristiques des marqueurs fluorescents, leurs longueurs d’onde d’excitation et de fluorescence, leur lumière d’excitation et les filtres requis. Dans le but de visualiser à la fois les marques de fluorescence et les marques de croissance des pc, il est possible d’utiliser simultanément l’épifluorescence et la lumière transmise (fig. IV.A.2).

2. Microscopie électronique

124Comme son nom l’indique, la microscopie électronique utilise les électrons à la place des photons de la microscopie photonique et offre ainsi la possibilité de grossissements et de résolutions nettement plus élevés. Deux principaux types de microscope sont disponibles : le microscope électronique à balayage (meb) et le microscope électronique à transmission (met). La plupart des études de sclérochronologie utilisent seulement le meb. Pour cette raison, nous ne décrirons ici que l’utilisation et les diverses recommandations pour le meb, et le lecteur pourra se référer aux nombreux ouvrages et articles spécialisés décrivant l’utilisation du met en cas de nécessité. Le meb se situe à une position intermédiaire entre le microscope photonique et le met en termes de résolution et d’information sur l’image observée. Son utilisation peut également être rapprochée de la microscopie épi-réfléchie (chap. VIII.D.1.2.3.3).

2.1. MEB

125Le meb est un outil d’observation de la topographie de surface, très répandu dans les études sur les otolithes. Ce type d’instrument offre la possibilité d’augmenter la profondeur de champ d’au moins 300 fois par rapport au meilleur microscope phonique, comme le montre la plupart des superbes images 3D qu’il fournit. De plus, les interactions entre le faisceau d’électrons et les échantillons sous le meb peuvent donner des informations utiles sur la composition chimique de leur surface, tout comme sur leurs caractéristiques cristallographiques, magnétiques et électriques. Pour les analyses microchimiques, le meb est couplé à une microsonde électronique à énergie dispersive (chap. VII.G.l).

2.1.1. Caractéristiques du MEB

126Le faisceau d’électrons utilisé pour bombarder l’échantillon analysé est accéléré avec un voltage de 1 à 30 kilovolts. Les interactions entre ce faisceau et l’échantillon créent des micro-courants qui sont utilisés pour générer une image qui peut donner trois types de résultat :

  • certains électrons primaires, dépendant du voltage d’accélération employé, pénètrent dans un corps solide jusqu’à une profondeur de 10 micromètres. Leur trajectoire varie et ils perdent d’autant plus d’énergie qu’ils pénètrent profondément dans l’échantillon ;

  • certains électrons primaires interagissent avec les atomes des couches les plus superficielles et il existe un échange momentané (mais pas un échange d’énergie) provoquant une rétrodiffusion des électrons avec un angle très large ; ces derniers sont ensuite effectivement réfléchis à la surface de l’échantillon. Ces électrons primaires réfléchis de façon élastique sont encore appelés « électrons rétrodiffusés » ;

  • certains électrons primaires interagissent avec les atomes hôtes et le résultat de ces collisions entraîne l’apparition « d’électrons secondaires » qui naissent au fur et à mesure de la pénétration du faisceau. Certains de ces électrons qui sont situés dans les couches les plus superficielles diffusent sur la surface de l’échantillon et perdent graduellement de l’énergie au cours de ce processus. Cependant, ils peuvent s’échapper s’ils accumulent assez d’énergie : ce processus est connu comme une « émission d’électrons secondaires » ;

  • les interactions faisceau-échantillon, tout en produisant des électrons rétrodiffusés et secondaires, produisent aussi des protons, des courants dans l’échantillon, les électrons Auger et des rayons X, qui sont caractéristiques de l’échantillon traversé. Si, en principe, tout signal généré est susceptible de pouvoir fournir une image, dans la pratique ce sont les électrons secondaires peu énergétiques, émis par l’échantillon, qui sont le plus fréquemment utilisés pour produire une image. En utilisant les électrons émis en surface plutôt que ceux qui passent à travers l’échantillon comme en met, on obtient des images de surface avec une qualité tridimensionnelle.

127L’impression de visualiser une surface 3D sur l’image est le résultat de la distribution de zones de lumières sombres et claires. Cette distribution est principalement due au fait que le faisceau incident génère plus d’électrons secondaires récupérables par unité de surface lorsqu’il touche des bords abrupts ou des surfaces inclinées que lorsqu’il frappe une surface plane. Les échantillons biologiques, dont les bords sont bien dessinés, facilitent l’induction de tels effets différentiels. Lorsque la surface est lisse, l’inclinaison de l’échantillon par rapport à la sonde augmentera le contraste et le nombre d’électrons secondaires collectés. Des effets plus subtils interviennent également dans ce processus en fonction de la manière dont une structure déposée sur une surface primaire va dévier ou absorber le faisceau d’électrons. Dans tous les cas, les « ombres » visualisées sont une représentation réelle de l’image 3D de la surface de l’échantillon étudié.

128En fonction du potentiel d’accélération utilisé, qui se situe en général autour de 15 kV pour l’observation des otolithes, le rapport entre les électrons secondaires peu énergétiques et les électrons rétrodiffusés très énergétiques variera. Des voltages plus élevés, même s’ils pénètrent encore plus en profondeur la surface des échantillons, produisent des charges électroniques à cause de la faible conductivité de l’aragonite.

2.1.2. Préparation des échantillons

129Les techniques de préparation qui sont mises en œuvre pour le MEB dépendent des objectifs de l’étude : (1) observation ultrastructurale ou (2) morphologie.

130Par exemple, pour révéler la structure interne d’un otolithe, il est nécessaire de le couper le long d’un plan de coupe principal (chap. VIII.C.2.3). À cause du faible pouvoir de pénétration du meb, le niveau de section doit être fait précisément dans la zone de l’otolithe choisie. Lorsque ce plan a été atteint et vérifié, la surface doit être polie (chap. VIII.C.2.5). Une lumière réfléchie montrant la surface de l’échantillon permet de vérifier la qualité de la préparation durant cette étape (chap. VIII.D.1.1.4.2). Dans le but d’éliminer tout matériel étranger accroché à l’otolithe, la préparation doit être ensuite nettoyée dans un bain à ultrasons dans de l’eau déionisée pendant 15 à 30 secondes. Après nettoyage, la coupe doit être attaquée pour révéler son ultrastructure. Les agents chimiques les plus fréquemment utilisés pour une attaque acide sont le HCl dilué (2 %, pH 2,0-5,0) et l’edta (pH= 7,2-7,6) (chap. VIII.C.2.6). Le temps d’attaque (1 à 10 min) dépend de l’espèce étudiée ainsi que de la température de la pièce. Des essais préalables doivent donc être réalisés pour déterminer le temps requis pour obtenir de bons résultats (chap. VIII.C.2.6).

131Pour les études de morphologie, la pc entière est observée et seul un nettoyage préalable est nécessaire avant les prochaines étapes de préparation pour le meb.

132Les échantillons doivent être ensuite séchés à 30 °C pendant 6 à 8 heures et laissés à l’abri de la poussière. Ils sont alors attachés à des plots porte-objet, spéciaux pour le meb, avec de la peinture au carborundum, de la colle thermofusible ou du ruban adhésif double-face. Un pont de colle argentée doit être déposé entre la surface de la préparation et le plot métallique pour éviter la création de charges électrostatiques à la surface de la préparation pendant l’observation. La surface de la section est alors métallisée avec de l’or (100 angströms pour une observation topographique) ou du carbone (10-50 angströms pour une analyse microchimique) avant l’observation finale au meb.

3. Microradiographie (F.J. Meunier)

133Dans certains cas, la meilleure technique pour visualiser les marques de croissance des os est la microradiographie de sections polies (fig. VIII.D.2) (Caillet et al., 1983 ; Casselman, 1983 ; Gruber & Stout, 1983 ; Yudin & Cailliet, 1990 ; Boujard & Meunier, 1991 ; Francis & Mulligan, 1998). Le principe de cette technique est le même que celui utilisé pour la radiographie médicale, mais nécessite bien sûr un appareil adapté à l’observation de petits objets calcifiés, comme par exemple les coupes poncées (Boivin & Baud, 1984, inter alia). Les coupes (chap. VIII.C.2.3.1) sont délicatement déposées sur des films radiographiques à haute résolution (Kodak SO643 ou équivalent) (fig. VIII.D.2a) puis exposées alors dans un générateur à rayons X qui produit des rayons de 10-30 kV à 10-15 milliampères, en fonction des différents réglages. Les films sont développés avec un révélateur spécial pour films de type HRP, lavés et fixés. Ils sont alors observés directement avec une loupe binoculaire ou un microscope après un simple montage entre deux lames de microscopie (fig. VIII.D.2b).

Figure VIII.D.2 - Microradiographie de coupes de rayons de nageoire (Hoplosternum littorale). a) Dans une chambre noire, les coupes de rayons de nageoire (flèche rouge) sont déposées sur un film photographique (flèche jaune) avant d’être soumises aux rayons X. b) Résultat de la microradiographie à différents grossissements (photos © Ifremer O. Dugornay).

E. Conservation des préparations

W.J. McCurdy

1. Conservation des préparations de pièces calcifiées

134Un lieu de stockage frais et à l’obscurité est certainement le meilleur endroit pour conserver la plupart des préparations de pc. La méthode de conservation sélectionnée devra protéger les pc d’une détérioration ultérieure mais aussi d’une perte ou de dommages mécaniques. Toutes les pc conservées doivent être référencées de façon appropriée et une copie de ces références doit être mise à l’abri dans un endroit sûr. Le tableau VIII.E liste les principales méthodes de conservation pour les préparations de pièces calcifiées.

Tableau VIII.E - Méthodes de conservation pour différentes préparations de pièces calcifiées.

Préparation de pc

Conservation

Récipients de stockage

Ecailles non montées

À sec

Microtubes, enveloppes de papier ou sachets en plastique

Écailles montées sur des lames de microscopie

À sec

Boîtes de lames de microscopie ou autres boîtes

Impressions d’écailles sur acétate de cellulose

À sec

Boîtes de stockage

Petits otolithes non montés

1. À sec
2. ≥ 95 % alcool

1. Microtubes ou lames en plastique
2. Microtubes

Grands otolithes non montés (entiers et cassés)

À sec

Récipients isolés ou enveloppes de papier

Otolithes de larves directement enrobés

Milieu de montage

Boîtes de lames de microscopie et autres boîtes de stockage

Lames de plastique avec nombreux otolithes

Milieu de montage

Boîtes de lames spécialement adaptées et autres boîtes de stockage

Lames minces d’otolithes montés

Milieu de montage

Boîtes de lames de microscopie et autres boîtes de stockage

Plusieurs lames minces d’otolithes montés sur des lames de microscopie

Milieu de montage

Boîtes de lames spécialement adaptées et autres boîtes de stockage

Pièces du squelette entières

À sec à l’abri des insectes et des champignons

Enveloppes de papier, conteneurs individuels ou subdivisés

Lames minces de pièces du squelette montées

Milieu de montage

Boîtes de lames de microscopie et autres boîtes de stockage

Pièces du squelette préparées pour une section

Milieu d’enrobage

Conteneurs individuels ou subdivisés

2. Écailles

2.1. Écailles non montées

135Les écailles sont habituellement conservées à sec (chap. VIII.B.2). Des enveloppes en papier pré-imprimées et des pochettes en plastique spéciales sont souvent utilisées lorsque de grands nombres d’écailles doivent être stockés, e.g. pour le saumon de l’Atlantique nord, Salmo salar, et pour d’autres espèces de Salmonidés. Les enveloppes et sachets contenant les écailles doivent être rangés dans des boîtes rigides référencées pour éviter le risque de perte ou de détérioration. Des microtubes référencés peuvent être également utilisés pour conserver à la fois les écailles et les otolithes. Ces microtubes peuvent être stockés sur des supports spéciaux (chap. VIII.B.3.3.2).

2.2. Écailles montées et impressions d’écailles

136Les méthodes de préparation pour le montage des écailles sur des lames de microscopie et les empreintes d’acétate de cellulose sont décrites dans le chapitre VIII.C.1.2 et le chapitre VIII.C.1.3. Les lames de microscopie peuvent être conservées dans des boîtes de lames spécialement destinées à cet effet et les impressions sur acétate dans des boîtes adaptées, dans un endroit frais.

3. Otolithes

3.1. Collections d’otolithes

137Les otolithes sont souvent prélevés par paire, même si un seul otolithe est utile pour les analyses. Ceci est fait pour de multiples raisons mais c’est presque toujours une pratique routinière lorsque l’on échantillonne les sagittae chez les poissons adultes. Parfois, un seul otolithe est systématiquement utilisé pour les analyses (par exemple, pour certains poissons plats comme la plie, Pleuronectes platessa) mais souvent l’otolithe est sélectionné au hasard. Dans tous les cas, l’otolithe non utilisé doit être préservé car il peut être utile pour d’autres informations sclérochronoiogiques. Le manque d’otolithes pour les individus les plus âgés dans certains biotopes et les avancées dans le domaine de la microchimie des otolithes ont souligné l’importance du stockage de ces otolithes. Les collections d’otolithes existantes ont encore besoin d’être évaluées, cataloguées et conservées, avec les références correspondant aux otolithes et à l’histoire de vie des poissons qui les possédaient, et elles devraient aussi être plus accessibles à l’ensemble de la communauté scientifique.

3.2. Otolithes entiers et cassés

138De nombreux otolithes ont une forme concavo-convexe et les otolithes les plus petits sont fins et fragiles. S’ils sont stockés dans des enveloppes en papier, comme il avait pu être recommandé auparavant (Williams & Bedford, 1974), il existe un risque important pour qu’ils soient endommagés chaque fois qu’ils seront manipulés. Les otolithes non montés peuvent être stockés dans des microtubes référencés (chap. VIII.B.3.3.2) ou dans des portoirs ou des cuvettes avec capuchon. Quelques auteurs recommandent une conservation dans de l’alcool >95 %, ce qui peut être utile pour les otolithes petits et fragiles (chap. VIII.B.3.3.2). Les grands otolithes de Gadidés sont fréquemment conservés dans des plaques de stockage avec des puits, qui sont des plaques en plastique transparent (avec par exemple 25 puits de 2 cm) possédant un couvercle qui est fixé grâce à du ruban adhésif.

139Lorsque de l’eau ou de l’alcool a été utilisé comme liquide éclaircissant pour l’observation, les otolithes, qu’ils soient entiers ou cassés, sont essuyés avec un tissu papier sec assez souple et sont conservés à nouveau dans leur emballage d’origine (chap. VIII.B.3.3.2). Si des huiles essentielles (chap. VII1.D.1.1.2) ont été utilisées pour améliorer la qualité de l’observation, elles doivent également être essuyées avant de remettre les otolithes dans leur récipient de stockage. Les otolithes des petits pélagiques (par exemple ceux du sprat, Sprattus sprattus) sont souvent stockés et observés sur des lames de plastique spécialement moulées et contenant des cupules. Chaque fois qu’un produit, comme l’eau ou l’alcool, est utilisé pour observer ce genre d’otolithes, il doit être laissé à évaporer avant de repositionner le verre ou le plastique de protection couvrant l’ensemble. Les lames sont alors conservées dans des boîtes spécialement adaptées.

3.3. Otolithes enrobés et en lames minces

140Les otolithes individuels, par exemple ceux des larves, peuvent être conservés directement dans un produit de montage (chap. VIII.C.2.4.2). Les otolithes, entiers ou en lames minces, montés sur des lames de microscopie ou sur des plaques de plastique contenant plusieurs paires d’otolithes (chap. VIII.C.2.2.3), peuvent être stockés sur des plateaux en plastique ou en métal. Ces derniers doivent être conservés dans des récipients adaptés les protégeant. Il est très important de standardiser le plus possible ces processus. Les lamelles couvre-objet recouvrant les préparations peuvent se briser facilement si la quantité de produit de montage n’est pas suffisante. Un excès de ce genre de produit peut également conduire au collage des préparations pendant le stockage. Nous recommandons l’emploi de lamelles couvre-objet spécialement découpées et ayant une épaisseur de 0,5 mm lorsque l’on utilise de la résine polyester comme produit enrobant de nombreux otolithes (chap. VIII.C.2.3.2, chap. VIII.C.2.4.3). Des lamelles plus fines peuvent se craqueler ou se briser pendant la manipulation et l’observation.

4. Autres éléments du squelette

141La conservation est très simple et se fait généralement à sec. Les os sont mieux conservés en les replaçant dans leurs enveloppes d’origine. Des précautions doivent être prises pour éviter le développement de champignons ou les attaques par des insectes spécialisés (chap. VIII.B.4.2). Pour les échantillons les plus fragiles, l’éthanol entre 70 et 90 % peut être utilisé comme fixateur-conservateur (Meunier, 1988), (chap. VIII.B.4.2). Si l’alcool est utilisé, le matériel calcifié doit être conservé dans des récipients référencés spécifiques. Les coupes de tissus montées sur des lames de microscopie peuvent être stockées dans des boîtes de rangement de lames adaptées. Les échantillons les plus gros et le matériel inclus pour une section ultérieure doivent être conservés individuellement dans des récipients adaptés.

Table des illustrations

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Légende Figure VIII.B.1Extraction d’écailles chez un Salmonidae (Salmo trutta), avec l’aide de pinces fines, dans la région médio-dorsale. A, antérieur ; D, dorsal ; P, postérieur ; V, ventral (photo © Ifremer O. Dugornay).
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Légende Figure VIII.B.2. - Prélèvement d’otolithes à partir d’une section frontale de la tête, a, b, c, d, e : Espèce de petite taille (Vinciguerria nimbaria, Photichthyidae, 4 cm LS), a’, b’, c’, d’, e’ : Espèce de taille moyenne (Trisopterus luscus, Gadidae, 25 cm LS), a) Vue latérale de la section frontale avec la lame de scalpel, a’) Vue dorsale de la section frontale avec le couteau de découpe, b, b’) Vues de la section frontale après suppression de la partie dorsale du crâne et des muscles, c, c’) Localisation du cerveau (flèche blanche) avant sa suppression, d, d’) Localisation des otolithes après avoir supprimé le cerveau ; les flèches blanches indiquent la localisation des oreilles internes et les flèches noires montrent les sagittae. e, e’) Extraction de l’otolithe (sagitta) avec des pinces fines ; les flèches blanches indiquent la localisation des cavités de l’oreille interne et les flèches noires montrent les otolithes (sagittae). A, antérieur ; D, dorsal ; Dr, droite ; G, gauche ; P, postérieur ; V, ventral (photos © Ifremer O. Dugornay).
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Légende Figure VIII.B.3 - Prélèvement d’otolithes à partir d’une section transversale de la tête, a, b, c : Espèce de petite taille (Vinciguerria nimbaria, Photichthyidae, 4 cm LS), a’, b’, c’ : Espèce de taille moyenne (Trisopterus luscus, Gadidae, 25 cm LS), a) Vue latérale de la section transversale avec la lame de scalpel, a’) Vue dorsale de la section transversale avec le couteau de découpe, b, b’) Extraction de l’otolithe (sagitta) avec l’aide de pinces fines et après suppression du cerveau, c, c’) Prélèvement des otolithes (sagittae) ; les flèches blanches indiquent la localisation des cavités des oreilles internes ; les flèches noires montrent les otolithes. A, antérieur ; D, dorsal ; Dr, droite ; G, gauche ; P, postérieur ; V, ventral, (photos © Ifremer O. Dugornay).
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Légende Figure VIII.B.4 - Prélèvement d’otolithes à partir d’une section sagittale de la tête, a, b, c, d : Espèce de petite taille (Vinciguerria nimbaria, Photichthyidae, 4 cm LS), a’, b’, c’, d’ : Espèce de taille moyenne (Trisopterus luscus, Gadidae, 25 cm LS), a) Vue dorsale de la section sagittale avec la lame de scalpel, a’) Vue médio-dorsale de la section sagittale avec le couteau de découpe, b, b’) Vues de la localisation du cerveau (flèche blanche) dans la demi-tête, c, c’) Suppression du cerveau avec des pinces fines à l’intérieur de chaque demi-tête, d, d’) Extraction d’un otolithe (sagitta) avec des pinces fines ; les flèches blanches indiquent la localisation des cavités de l’oreille interne ; les flèches noires montrent l’otolithe (sagitta). A, antérieur ; D, dorsal ; Dr, droite ; G, gauche ; P, postérieur ; V, ventral (photos © Ifremer O. Dugornay).
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Légende Figure VIII.B.5 - Prélèvement d’otolithes à partir d’une section ventrale de la tête à travers les branchies chez Gadus morhua (Gadidae). a) Vue ventrale de l’ouverture de l’opercule et section des arcs branchiaux avec un couteau. b) Vue ventrale de la base du crâne (pointée par la lame de couteau). c) Extraction de l’otolithe (sagitta) après découpe du crâne ; la flèche blanche indique la localisation des cavités de l’oreille interne ; la flèche noire montre l’otolithe (sagitta). A, antérieur ; Dr, droite ; G, gauche ; P, postérieur (photos © Ifremer O. Dugornay).
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Légende Figure VIII.B.6 - Prélèvement d’otolithes de larves sous une loupe binoculaire en lumière polarisée chez Vinciguerria nimbaria (Photichthyidae). Les otolithes sont facilement localisés grâce à leur réfringence sous la lumière polarisée, a) Vue dorsale de la face antérieure d’une larve ; S, sagitta ; L, lapillus ; échelle = 500 μm (photo J. Tomás), b) Prélèvement d’otolithes avec l’aide de minuties ; les os crâniens et le cerveau sont enlevés avant l’isolement de la sagitta (flèche jaune) et du lapillus (flèche rouge) ; échelle = 1 mm (photo © Ifremer O. Dugornay).
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Légende Figure VIII.B.7 - Prélèvement de rayon de nageoire chez un poisson de grande taille : Thunnus alalunga (Scombridae). a) Vue dorsale du prélèvement du premier rayon de nageoire avec un couteau, b) Une coupe transversale est faite au niveau de la peau avant et après le rayon choisi. Ce dernier est extrait en s’assurant de l’intégrité de la totalité de l’os. A, antérieur ; D, dorsal ; P, postérieur ; V, ventral (photos © Ifremer O. Dugornay).
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Légende Figure VIII.B.8 - Prélèvement de vertèbres caudales chez un poisson de grande taille : Thunnus alalunga (Scombridae). a) Section avec l’aide d’un couteau et suppression de la peau et des muscles au-dessus des dernières vertèbres, b) Une coupe est faite entre deux vertèbres et les corps vertébraux (flèches) sont extraits après section des arcs vertébraux. A, antérieur ; D, dorsal ; P, postérieur ; V, ventral (photos © Ifremer O. Dugornay).
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Légende Figure VIII.C.1 - Montage d’écailles entre deux lames, a) Les écailles (flèche rouge) sont positionnées sur la lame référencée (flèche jaune). Il est préférable que les écailles soient humidifiées dans le but de pouvoir les déformer (compresser) plus facilement lors du montage, b) Une deuxième lame (flèche jaune) est déposée sur la précédente et vient comprimer les écailles. Les deux lames (flèches jaunes) sont fixées ensemble en utilisant du ruban adhésif (photos © Ifremer O. Dugornay).
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Légende Figure VIII.C.2 - Impression d’écaille sur feuille d’acétate de cellulose, a) Les écailles (flèche rouge) sont positionnées entre 2 feuilles d’acétate (flèches jaunes). L’ensemble est passé entre les deux rouleaux d’une presse (e.g. presse de joaillier), b) La face externe de l’écaille (flèche rouge) est alors séparée de la feuille d’acétate (flèche jaune) et son empreinte reste visible (flèche jaune) (photos © Ifremer O. Dugornay).
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Légende Figure VIII.C.3 - Préparation de la résine d’enrobage sous une hotte d’extraction, a) Exemple de mélange en fonction du poids (e.g. résine époxy). Le catalyseur (flèche verte) est ajouté à la résine (flèche rouge) dans un bécher en polypropylène posé directement sur une balance. Le mélange doit ensuite être remué, b) Exemple de mélange direct à partir d’un nombre de gouttes (e.g. résine polyester). Les gouttes de catalyseur (flèche verte) sont ajoutées à la résine (flèche rouge) dans un bécher en polypropylène en fonction du volume de résine. Le mélange doit ensuite être remué (photos © Ifremer O. Dugornay).
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Titre Tableau VIII.C.2 - Dosages simples de la résine polyester (en volume et/ou poids) et du catalyseur (en nombre de gouttes) en fonction de leurs proportions. Plus la quantité de catalyseur est importante et plus la vitesse de polymérisation est élevée. Le préparateur ne doit pas dépasser un seuil de 2 % de catalyseur pour éviter les risques d’explosion.
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Légende Figure VIII.C.4 - Exemple d’enrobage : otolithe enrobé à l’intérieur d’un moule en élastomère de silicone. a) Une couche de résine (flèche jaune) a été coulée au préalable dans le fond de chaque moule : après polymérisation, elle devient la base de support pour l’otolithe (flèche rouge). Chaque otolithe est déposé sur le fond de résine durcie. b) L’otolithe est orienté convenablement et il est enrobé dans une deuxième couche de résine qui vient juste d’être préparée (flèche jaune). c) Il faut s’assurer que la résine encore à l’état liquide (flèche jaune) vienne remplir complètement le moule. Sur l’exemple présenté la résine n’atteint pas encore le bord droit du moule. L’otolithe doit alors être retourné pour éliminer les bulles d’air prisonnières. d) Otolithe (flèche rouge) enrobé définitivement dans la résine polymérisée (flèche jaune). Le bloc de résine porte un numéro d’identification (20) moulé en empreinte sur la face inférieure (photos © Ifremer O. Dugornay).
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Légende Figure VIII.C.5 - Enrobage d’otolithes entiers sur des plaques en plastique noir. a) Positionnement des otolithes dans les cavités des plaques spécialement préparées. b) Remplissage des cavités avec de la résine et son catalyseur. c) Positionnement de la lamelle couvre-objet sur la plaque. d) Vue de la plaque complète terminée (photos R. Rosell).
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Légende Figure VIII.C.6 - Enrobage d’otolithes en série dans des moules en aluminium. a) Vue des moules en aluminium. b) Système de contrôle d’alignement dans les moules avec l’aide d’un système vidéo (photos Bennett Ltd.). c) Rangées d’otolithes (flèche rouge) déposées sur un fond de résine polyester préalablement colorée en noire et laissée à polymériser. La seconde couche de résine polyester noire (flèche jaune) est versée dans le moule (photo © Ifremer O. Dugornay).
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Titre Tableau VIII.C.3 - Table de mélanges de la résine polyester utilisée pour la préparation de type « Otolin ».
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Légende Figure VIII.C.7 - Section des pièces calcifiées : exemples de coupe d’un otolithe enrobé dans de la résine et de coupe d’une épine dorsale entière dans le but d’obtenir des tranches. a) Localisation des niveaux de coupe (flèches rouges) pour obtenir une tranche d’otolithe contenant le noyau. b) Découpe à l’aide d’une scie rotative à vitesse lente (Isomet®, Buehler Ltd). Le bloc de résine contenant l’otolithe (flèche rouge) est coupé par un disque diamanté (flèche jaune) en rotation (flèche bleue). Le disque est humidifié en permanence. c) Détail de la figure précédente. Le disque diamanté (flèche jaune) tourne pendant que le bloc de résine est appuyé directement dessus en pression. Le niveau de section est indiqué par les flèches rouges. d) Section d’une tranche dans une épine dorsale entière. Le courant d’eau est visible à l’interface entre l’épine (flèche rouge) et le disque diamanté (flèche jaune) (photos © Ifremer O. Dugornay).
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Légende Figure VIII.C.8 - Section d’otolithes en série avec une scie diamantée (flèche jaune) à grande vitesse. a) La première section traverse les otolithes. Le niveau de section a été localisé au préalable directement sur la résine colorée en noir. b) La deuxième section permet d’obtenir la tranche contenant les otolithes (flèche rouge). Le courant d’eau (flèche bleue) arrive directement sur le disque diamanté (flèche jaune). c) Résultat final de la lame contenant les otolithes en série (photos © Ifremer O. Dugornay). (d) Vue de la scie diamantée à grande vitesse du système Otolin (photo Bennett Ltd.).
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Titre Tableau VIII.C.4 - Préparations des lames minces d’otolithes utilisées pour l’estimation de l’âge de Merlangus merlangius L. dans différents instituts de recherche européens (ices, 1998).
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Légende Figure VIII.C.9 - Section d’épine avec l’aide d’un cryotome. a) Une épine décalcifiée (flèche rouge) est enrobée dans de la glace (flèche blanche). La lame du cryotome (flèche jaune) se déplace vers l’avant (flèche rose) et vient couper de très fines tranches de l’épine congelée (flèche rouge sur la lame). b) Les coupes minces (flèche rouge), encore enrobées de glace (flèche blanche), sont déposées à la surface de l’eau (flèche bleue). Après décongélation, les coupes flottent à la surface (flèche rouge) et peuvent ainsi être récupérées (photos © Ifremer O. Dugornay).
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Légende Figure VIII.C.10 - Montage de préparation : exemple de collage d’une tranche d’otolithe avec de la colle thermofusible et retournement sur une plaque chauffante. a) Collage de l’otolithe avec la colle thermofusible (e.g. Crystal Bond™). Le bloc contenant la tranche (flèche rouge) est amené (flèche grise) sur la colle thermofusible encore à l’état visqueux (flèche jaune). b) La tranche est poussée en pression (flèche grise) sur la colle (flèche jaune). Cette pression chasse les bulles d’air captives dans la colle sous la préparation. La tranche d’otolithe (flèche rouge) est en fait collée (flèche jaune) sur un morceau de lame de verre lui-même collé sur une lame de microscopie (flèches vertes). c) Vue de la préparation terminée et enlevée de la plaque chauffante. d) Retournement du bloc de résine. Lorsque la colle thermofusible est suffisamment liquide à haute température (flèche jaune), la tranche est retirée, retournée (flèche grise), et re-déposée sur la colle sur le morceau de lame de verre (flèche verte). La préparation alors terminée est retirée de la plaque chauffante (photos © Ifremer O. Dugornay).
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Légende Figure VIII.C.11 - Exemple de montage de pièces calcifiées. a) Enrobage d’otolithes de larve dans de la résine. Les otolithes (flèches rouges) sont déposés à l’aide d’une minutie (flèche verte) dans une goutte de résine polyester (flèches jaunes) sur une lamelle de microscopie. Chaque otolithe a été lui-même transporté dans une goutte de résine positionnée au bout de la minutie. L’image de droite est une vue grossie de l’opération. Échelle = 1 mm. b) Enrobage d’une coupe fine et colorée d’épine dans de la résine. La coupe (flèche rouge) est déposée dans une résine hydrophile (flèches jaunes) en utilisant des minuties (photos © Ifremer O. Dugornay).
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Légende Figure VIII.C.12 - Ponçage et polissage des préparations. a) Ponçage. La préparation, une tranche d’otolithe montée sur une lame de microscopie (flèches rouges), est poncée à la main sur un papier abrasif à l’eau (flèches jaunes). Le mouvement de la main est irrégulier (flèches grises doubles) pour éviter un rodage unidirectionnel et des rayures systématiques. b) Polissage. La préparation, une tranche d’otolithe montée sur une lame de microscopie (flèches rouges), est polie sur un disque de feutre (flèches jaunes) avec de la poudre d’alumine (poudre blanche) et de l’eau. Le mouvement de la main est irrégulier (flèches grises doubles) pour éviter un polissage unidirectionnel et des rayures systématiques (photos © Ifremer O. Dugornay).
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Légende Figure VIII.C.13 - Brûlage et cassure d’otolithe. a) L’otolithe est placé directement dans une flamme avec l’aide de pinces fines. b) La partie protéique de l’otolithe brûle au bout de quelques instants. La durée du brûlage est variable en fonction de l’espèce considérée et de la taille de l’otolithe. L’otolithe doit acquérir une couleur brune. c) L’otolithe brûlé est ôté de la flamme et il est cassé par le milieu sur un support rigide avec l’aide d’une lame de scalpel (photos © Ifremer O. Dugornay).
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Légende Figure VIII.C.14 - Coloration. a) b) Coloration d’otolithe. Une coupe transversale d’un otolithe enrobé dans de la résine et attaqué à l’acide (flèche rouge) est colorée par dépôt d’une solution de bleu de toluidine. La préparation doit ensuite être abondamment rincée pendant quelques temps avec de l’eau distillée. c) Coloration de coupes d’épine décalcifiée. Les coupes d’épine, flottant dans de l’eau distillée, sont recouvertes d’une solution colorante (hématoxyline d’Ehrlich). La préparation doit ensuite être abondamment rincée pendant plusieurs minutes avec de l’eau distillée (photos © Ifremer O. Dugornay).
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Légende Figure VIII.D.1 - De gauche à droite, otolithe entier de Pleuronectes platessa, coupe d’épine de Pangassius hypophthalmus et écaille de Dicentrarchus labrax, observés en lumière transmise directe (a), en lumière transmise en diascopie (b) et en lumière réfléchie sur fond noir (c). Échelle = 200 μm (photos J. Panfili).
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Légende Figure VIII.D.2 - Microradiographie de coupes de rayons de nageoire (Hoplosternum littorale). a) Dans une chambre noire, les coupes de rayons de nageoire (flèche rouge) sont déposées sur un film photographique (flèche jaune) avant d’être soumises aux rayons X. b) Résultat de la microradiographie à différents grossissements (photos © Ifremer O. Dugornay).
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