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Biotechnologies du palmier dattier

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Frédérique Aberlenc-Bertossi

Partie 5. Lutte contre les maladies du palmier dattier

Contribution à l’étude transcriptomique de la maladie des feuilles cassantes chez le palmier dattier en Tunisie (Phoenix dactylifera L.)

Soumaya Rhouma, Sonia Dakhlaoui-Dkhil, Emira Cherif, Ali Ould Boukhary Ould Mohamed Salem, Salwa Zehdi-Azouzi et Mokhtar Trifi

Texte intégral

Introduction

1Le palmier dattier (Phœnix dactylifera L.) est considéré comme étant l’arbre de vie dans les régions sahariennes des pays de l’Afrique du Nord et du Moyen-Orient. En effet, cette plante dioïque et pérenne, constitue l’axe principal de l’agro-système oasien. A ce sujet, le palmier dattier joue un important rôle socioéconomique en Tunisie. En outre, il constitue la base de la production agricole ainsi que la principale source financière et alimentaire des oasiens. Cependant, en dépit de leur richesse génétique qualitative considérable, nos palmeraies sont actuellement doublement exposées aussi bien à une érosion génétique qu’à des maladies diverses dont la maladie des feuilles cassantes (MFC). Ce fléau a été observé pour la première fois en 1985 dans la corbeille de Nefta (Takrouni et al., 1988) et, depuis, il n’a cessé de prendre de l’ampleur pour se répandre vers les oasis de Dégache, Tozeur et Kébili où de nouveaux foyers ont été signalés. A ce sujet, le nombre total d’arbres touchés par cette maladie est passé de 4 700 en 1991 à plus de 36 000 arbres en 2002 (Triki et al., 2003). Notons que cette maladie touche l’arbre indépendamment de son âge, y compris : les rejets, les jeunes plants, les pollinisateurs et même les rejets plantés en remplacement des palmiers décimés (Takrouni et al., 1988). Elle se manifeste au premier stade par un jaunissement particulier de couleur d’huile d’olive de la foliole qui devient translucide, les cellules perdent leur turgescence ce qui leur confère un aspect facilement cassable (fig. 1), d’où l’appellation de la maladie (Takrouni et al., 1988). La croissance des palmiers affectés s’arrête et leur mort survient plus ou moins rapidement mais ils ne dépassent jamais 4 à 6 ans de survie (Takrouni et al., 1988).

Figure 1
Palmes prélevées sur des palmiers atteints de la maladie des feuilles cassantes : stade 1 (A) et stade 2 (B)

2Plusieurs hypothèses ont été émises afin de déterminer l’étiologie de cette maladie. A ce sujet, des analyses concernant le sol, l’eau d’irrigation et les feuilles ont révélé que la concentration en manganèse des feuilles affectées est dix fois inférieure à celle enregistrée chez les non affectées (Riahi-Sassi et al., 1997 et 1998 ; Namsi et al, 2007). En outre, d’autres travaux ont montré que l’apparition de la MFC n’est pas liée à la présence d’agents pathogènes dont les nématodes (Triki et al., 2003), les champignons (Waller, 1987 ; Triki et al., 2003) et les bactéries et les virus (Waller, 1987 ; Mehani, 1988 ; Triki et al., 2003). Il en est de même pour l’hypothèse d’une origine virale (Triki et al., 2003). Notons que des études récentes ont permis de mettre en évidence un marqueur moléculaire spécifique de la maladie. Il s’agit d’un ARN double brin circulaire de petite taille (372 à 467 pb) dont la présence est associée à la MFC (Rivera-Bustamante et al., 1986 ; Triki et al., 2003 ; Namsi et al., 2006). En ce qui nous concerne, notre intérêt a porté sur la mise à profit des apports de la technique « Differential Display Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction » (DDRT-PCR) pour explorer les transcrits différentiellement exprimés chez des palmiers présentant ou non les symptômes de la MFC. Dans le présent travail, nous rapporterons, les résultats obtenus en relation avec des perspectives de mise en évidence d’autres transcrits susceptibles d’être impliqués dans la manifestation de cette maladie.

Matériel et méthodes

3Au cours de ce travail nous avons utilisé des échantillons foliaires de palmier dattier cv Deglet Nour prélevés sur des plantes présentant les symptômes de la MFC (stade 2) et collectés dans l’oasis de Tozeur. De même, un échantillon foliaire indemne a été récolté sur des palmiers conservés à la collection du Centre de recherche régional de l’agriculture oasienne CRRAO situé à Dégache).

Extraction des ARN totaux

4Les ARNs totaux ont été purifiés à l’aide du tampon Trizol (un mélange de phénol et de thiocyanate de guanidium) selon le protocole préconisé par le fournisseur (Invitrogen, Cergy Pontoise, France).

Differential display

5La technique de tri d’ARNm (ou Differential Display) est une variante du criblage différentiel adaptée à l’identification d’ARNm différentiellement exprimés (Liang, Pardee, 1992). Elle est basée sur quatre étapes majeures :

  • transcription reverse à partir d’ARNm aboutissant à l’obtention d’ADNc monocaténaire (tabl. 1) ;
  • amplification par PCR de ces ADNc (tabl. 1) ;
  • séparation électrophorétique des fragments d’ADNc sur un gel de polyacrilamide dénaturant à 6 % ;
  • élution et séquençage des bandes différentiellement exprimées.

6Les séquences ainsi obtenues sont par la suite comparées à celles disponibles dans les banques de données disponibles sur le site du serveur NCBI par BLAST

Amorces

Code

Séquence (5’-3’)

Poly-T

H-T11AT

AAGCTTTTTTTTTTTTTAT

H-T11AA

AAGCTTTTTTTTTTTTTAA

H-T11AC

AAGCTTTTTTTTTTTTTAC

H-T11AG

AAGCTTTTTTTTTTTTTAG

H-T11CA

AAGCTTTTTTTTTTTTTCA

H-T11CT

AAGCTTTTTTTTTTTTTCT

H-T11CG

AAGCTTTTTTTTTTTTTCG

H-T11CC

AAGCTTTTTTTTTTTTTCC

H-T11GA

AAGCTTTTTTTTTTTTTGA

H-T11GC

AAGCTTTTTTTTTTTTTGC

H-T11GT

AAGCTTTTTTTTTTTTTGT

H-T11GG

AAGCTTTTTTTTTTTTTGG

Arbitraires

H-AP1

AAGCTTGATTGCC

H-AP2

AAGCTTCGACTGT

H-AP3

AAGCTTTGGTCAG

H-AP4

AAGCTTCTCAACG

H-AP5

AAGCTTAGTAGGC

Tableau 1
Séquences des amorces utilisées lors de la DD-RT-PCR

Résultats

7Les résultats ont montrés que par utilisation des différentes combinaisons d’amorces, plusieurs fragments exprimés différentiellement ont été obtenus (fig. 2). Le séquençage automatique de ces amplimères a permis de déterminer leurs séquences. La comparaison de ces dernières par BLAST dans les banques de données disponibles sur le site du serveur NCBI « National Center for Biotechnology Information » montre que certaines d’entre elles ne présentent aucune homologie significative et peuvent correspondre à des séquences non encore publiées (séquences orphelines). Par contre, d’autres présentent des homologies avec certaines espèces mais leur présence ne peut pas être associée à la MFC. Toutefois, en utilisant le couple d’amorces H-T11AA/AP1, une bande différentiellement exprimée a suscité notre intérêt. En effet, cet amplimère, qui est détecté uniquement chez le palmier atteint, correspond à une région du génome chloroplastique, en l’occurrence celle du gène rps14 GenBank : accession GI:76559634, (Shinozaki et al., 1986) qui code pour la protéine ribosomale S14. Ce résultat suggère l’implication de ce gène dans la manifestation de la MFC.

Figure 2
Séparation sur gel de polyacrylamide dénaturant des produits d’amplification des palmiers sains (S) et atteints (M) par la MFC. Les flèches indiquent quelques bandes différentiellement exprimées.
HT11AA : amorce utilisée pour la transcription inverse. AP1, AP2, AP3, AP4, AP5 : amorces arbitraires.
L: marqueur de poids moléculaire (100pb, GIBCO. BRL)

Conclusion

8Au cours de ce travail, nous avons tenté de mettre à profit les possibilités offertes par la technique de DD-RT-PCR pour mettre en évidence des transcrits différentiellement exprimés chez des palmiers atteints de la MFC. Les résultats obtenus ont permis de montrer la présence de plusieurs différences dans l’expression des gènes. Toutefois, si la présence de la majorité des amplimères ne semble pas être associée à la manifestation de la MFC, l’un d’entre eux s’est avéré particulièrement intéressant. En effet, ce dernier correspond à une région du génome chloroplastique couvrant le gène rps14 suggérant que la manifestation des symptômes de la MFC est fortement associée au fonctionnement du génome chloroplastique du palmier dattier. A ce sujet, plusieurs arguments sont en faveur de cette hypothèse :

  • les observations morphologiques montrent que les premiers symptômes de la MFC ne se traduisent par une décoloration foliaire. En effet, les feuilles atteintes virent du vert chlorophyllien au vert pâle ;
  • une étude protéomique comparée a révélé la présence des spots protéiques correspondant à des protéines chloroplastiques impliquées dans le transport du manganèse chez le palmier dattier.
  • des études moléculaires récentes ont permis de mettre en évidence un marqueur moléculaire spécifique de la maladie. Il s’agit d’un ARN double brin circulaire de petite taille (372 à 467 nt) dont la présence est associée à la MFC. La séquence de cet ARN présente de forte homologies à celle de deux régions différentes du génome chloroplastiques : rrn5s/trnR codant pour l’ARNr 5S, l’ARNt-Arg et la sous unité e de l’ATP synthase (Rivera-Bustamante et al., 1986 ; Triki et al., 2003 ; Namsi et al., 2006) ;
  • une analyse cytopathologique a montré la présence d’altérations tissulaires et des aberrations dans la structure des chloroplastes des feuilles atteintes de MFC.

9Tenant compte de toutes ces considérations, nos résultats associés à ceux rapportés dans la littérature montrent clairement l’implication du génome chloroplastique dans la manifestation de la MFC chez cette espèce.

10Quoi qu’il en soit, les résultats qui découlent de la présente étude ouvrent de nouvelles voies pour répondre, au moins en partie, aux différentes questions relatives à la manifestation de la MFC chez le palmier dattier. A ce sujet, une étude basée sur l’exploration du génome chloroplastique serait d’un grand apport pour contribuer efficacement à mieux élucider l’étiologie de la MFC.

Bibliographie

Bibliographie

Liang P., Pardee A. B., 1992 – Differential display of eukaryotic messenger RNA by means of the polymerase chain reaction. Science, 257 : 967-971.

Mehani S., 1988 – Compte rendu de mission de consultation auprès de la direction générale de la production végétale, Ministère de l’Agriculture, Tunis.

Namsi A., Marqués J., Fadda Z., Takrouni M. L., Ben Mahamoud O., Zouba A., Daròs J. A., Flores R., Bové J. M., Duran-Vila N., 2006 – Diagnosis of « maladie des feuilles cassantes » or brittle leaf disease of date palms by detection of associated chloroplast encoded double stranded RNAs. Molecular and cellular probes, 20 : 366-370.

Namsi A., Montarone M., Serra P., Ben Mahamoud O., Takrouni M. L., Zouba A., Khoualdia O., Bové J. M., Duran-Vila N., 2007 – Manganese and brittle leaf disease of date palm trees. Journal of plant pathology, 89 (1) : 125-136.

Riahi Sassi S., Srarfi F., Rhouma A., Ben Mahmoud O., 1997 – Contribution à l’étude de la maladie des feuilles cassantes du palmier dattier en relation avec les caractéristiques physico-chimiques du sol. Annales de l’Institut national de la recherche agronomique de Tunisie, 70 : 173-92.

Riahi-Sassi S., Rhouma A., Ben Mahmoud O., 1998 – Rôle des oligo-élements dans l’apparition de la maladie des feuilles cassantes du palmier dattier. Annales de l’Institut national de la recherche agronomique de Tunisie, 71 : 103-107.

Rivera-Bustamante R., Gin R., Semancik J. S., 1986 – Enhanced resolution of circular and linear molecular forms of viroid and viroid-like RNA by electrophoresis in a discontinuous-pH system. Analytical Biochemistry, 156, 91-95.

Shinozaki K., Ohme M., Tanaka M., Wakasugi T., Hayashida N., Matsubayashi T., Zaita N., Chunwongse J., Obokata J., Yamaguchi-Shinozaki K., Ohto C., Torazawa K., Meng B.Y., Sugita M., Deno H., Kamogashira T., Yamada K., Kusuda J., Takaiwa F., KATO A., Tohdoh N., Shimada H., Sugiura M., 1986 – The complete nucleotide sequence of the tobacco chloroplast genome: its gene organization and expression. Embo J., 5 (9) : 2043-2049.

Takrouni L., Rhouma A., Khoualdia O., Allouchi B., 1988 – Observations préliminaires sur deux graves « maladies » d’origine inconnue du palmier dattier en Tunisie. Ann. de l’Institut national de la recherche agronomique de Tunisie, 61: 2-16.

Triki M.A., Zouba A., Khoualdia O., Ben Mahamoud O., Takouni M.L., Garnier M., Bové J.-M., Montarone M., Poupet A., Flores R., Daros J. A., FADDA Z. G. N., Moreno P., Duran-Vila N., 2003 – Maladies des feuilles cassante or brittle leaf disease of date palms in Tunisia: biotic or abiotic disease. Journal of plant pathology, 85 (2) : 71-79.

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Table des illustrations

Légende Figure 1Palmes prélevées sur des palmiers atteints de la maladie des feuilles cassantes : stade 1 (A) et stade 2 (B)
URL http://books.openedition.org/irdeditions/docannexe/image/10798/img-1.jpg
Fichier image/jpeg, 154k
Légende Figure 2Séparation sur gel de polyacrylamide dénaturant des produits d’amplification des palmiers sains (S) et atteints (M) par la MFC. Les flèches indiquent quelques bandes différentiellement exprimées.HT11AA : amorce utilisée pour la transcription inverse. AP1, AP2, AP3, AP4, AP5 : amorces arbitraires.L: marqueur de poids moléculaire (100pb, GIBCO. BRL)
URL http://books.openedition.org/irdeditions/docannexe/image/10798/img-2.jpg
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Auteurs

Généticienne et biologiste moléculaire
Faculté des sciences de Tunis,
Laboratoire de génétique moléculaire
Campus universitaire El Manar I, 2092 Tunis, Tunisie
rhoumasoumaya@yahoo.fr

Généticienne et biologiste moléculaire
Faculté des sciences de Tunis,
Laboratoire de génétique moléculaire
Campus universitaire El Manar I, 2092 Tunis, Tunisie
sodakhlaoui@yahoo.fr

Généticienne et biologiste moléculaire
Faculté des sciences de Tunis,
Laboratoire de génétique moléculaire
Campus universitaire El Manar I, 2092 Tunis, Tunisie
Emira31_2000@yahoo.fr

Généticien et biologiste moléculaire
Faculté des Sciences et Techniques,
Université de Nouakchott, Mauritanie,
boukhary@univ-nkc.mr

Généticienne et biologiste moléculaire
Faculté des sciences de Tunis,
Laboratoire de génétique moléculaire
Campus universitaire El Manar I, 2092 Tunis, Tunisie
szehdi@yahoo.fr

Généticien et biologiste moléculaire
Faculté des sciences de Tunis,
Laboratoire de génétique moléculaire
Campus universitaire El Manar I, 2092 Tunis, Tunisie
moktar.t@fst.rnu.tn
trifimokhtar@yahoo.fr

© IRD Éditions, 2010

Conditions d’utilisation : http://www.openedition.org/6540

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