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Manuel de lutte contre la maladie du sommeil

 | 
Claude Laveissière
, 
Claude Penchenier

Partie III. Le dépistage et le diagnostic

Confirmation diagnostic

Texte intégral

LΑ DÉCISION THÉRAPEUTIQUE

1Le seul moyen de confirmer si un suspect clinique, ou sérologique, est effectivement trypanosomé consiste à rechercher le parasite dans les différents liquides de l’organisme : sang, lymphe (dans les ganglions), liquide céphalo-rachidien (LCR). Cette preuve tangible de l’infection est indispensable avant de commencer le traitement du fait des dangers liés à l’administration des trypanocides, notamment le mélarsoprol.

2La recherche des trypanosomes dans les ganglions est simple. Elle sera entreprise si l’on a mis en évidence des ganglions hypertrophiés dans les creux sus-claviculaires ou le long du cou.

3On trouve des trypanosomes dans les ganglions chez plus de la moitié des malades (environ 60 %) et il n’est pas rare d’en trouver alors que la recherche de parasites dans le sang est restée négative, mais l’inverse est également vrai. C’est donc une bonne technique de diagnostic qu’il ne faut pas écarter.

4La mise en évidence du parasite dans le sang peut être plus délicate car les trypanosomes n’y sont pas toujours présents ou la parasitémie est si faible qu’ils passent inaperçus. Dans les formes gambienne et rhodésienne de la maladie, les parasites apparaissent dans le sang du sommeilleux au cours de vagues parasitémiques à des intervalles plus ou moins réguliers (fig. 12, p. 62).

5Au cours d’une infection à T. rhodesiense, les pics parasitémiques sont espacés de 8 à 15 jours et le nombre de parasites est généralement très important.

6Au cours d’une infection à T. gambiense, les pics sont moins faciles à prévoir et peuvent varier de quelques jours à plusieurs mois. En outre, le nombre de parasites dans le sang peut rester en dessous du seuil de détection de la méthode utilisée.

7Pour toutes ces raisons, il faudra souvent faire appel aux techniques les plus performantes (y compris la biologie moléculaire lorsque cela est possible) durant une période prolongée afin de mettre les trypanosomes en évidence (recherche longitudinale).

8Un suspect sérologique chez qui les examens du sang et de la lymphe n’ont pas permis de détecter les trypanosomes peut déjà avoir atteint le deuxième stade de la maladie. Dans ce cas, il faudra prélever et examiner son LCR. Toutefois, l’altération simple du LCR ne suffit pas pour confirmer le diagnostic de la maladie du sommeil. La mise en évidence du parasite est toujours indispensable.

LE DIAGNOSTIC DE PHASE

9La phase de la maladie conditionne la nature des médicaments utilisés pour le traitement. Il faut donc effectuer un diagnostic de phase chez chaque malade. Ce diagnostic se fait à partir du liquide céphalo-rachidien dans lequel on tente de mettre en évidence la présence de trypanosomes, signe du passage en 2e période. Si le parasite ne peut y être décelé, on peut prendre la décision thérapeutique sur des éléments indirects comme le taux d’albumine ou le nombre de cellules dans le LCR. Nous retiendrons seulement ici qu’une personne chez laquelle aucun trypanosome n’a été détecté dans le sang ou les ganglions peut quand même être un malade en 2e période et que les trypanosomes peuvent n’être présents que dans le système nerveux central.

TECHNIQUES DE DIAGNOSTIC

Examen du suc ganglionnaire : la ponction

10Pour effectuer le diagnostic de la THA, y compris celui de la phase de la maladie, on procède à une série d’examens – du plus simple au plus sophistiqué – jusqu’à obtenir un résultat certain.

Matériel nécessaire

11Si la personne suspecte est porteuse d’adénopathies, il faut les ponctionner et examiner le suc ganglionnaire (lymphe). Pour cela, on doit disposer du matériel décrit dans l’annexe 15 (p. 300).

12Pour la réussite de l’examen, il est impératif que la seringue, la lame et la lamelle soient propres et sèches. Il est préférable, avant de commencer l’opération, de tirer à fond le piston de la seringue pour éviter d’aspirer machinalement le contenu de l’aiguille à la fin du prélèvement.

Technique de prélèvement

13Pour prélever le ganglion, on se place derrière le malade qui est assis ; avec du coton imbibé d’alcool, on nettoie soigneusement l’endroit où on va faire le prélèvement. Le ganglion est saisi entre le pouce et l’index de la main gauche (pour les droitiers) afin de l’immobiliser (fig. 16, p. 137). L’aiguille, tenue de la main droite, perpendiculairement au ganglion, doit passer entre le pouce et l’index tenant le ganglion, traverser la peau et pénétrer au centre du ganglion sans le dépasser (fig. 49). L’aiguille en place, on malaxe le ganglion avec la main gauche, pendant environ 30 secondes, tout en tournant l’aiguille sur son axe : le suc ganglionnaire monte de lui-même dans l’aiguille (fig. 50).

Figure 49. Position de l’aiguille

Figure 50. Prélèvement du suc ganglionnaire

Figure 51. Dépôt et étalement du suc ganglionnaire sur la lame

14En retirant l’aiguille, on place un doigt sur son extrémité plastifiée pour la boucher et éviter qu’elle ne se vide. On sort l’aiguille d’un mouvement rapide et le point de piqûre est désinfecté avec le coton imbibé de désinfectant (s’il est sale, on en prend un autre). Il ne faut jamais désinfecter avant d’avoir retiré l’aiguille : le produit pourrait entrer en contact avec le suc ganglionnaire dans l’aiguille et tuer les trypanosomes, ce qui rendrait la lecture microscopique difficile, voire impossible.

15Quand l’aiguille est retirée, on la place au bout de la seringue dont on a, au préalable, tiré le piston à fond (fig. 51). La pointe de l’aiguille est placée au centre de la lame et on pousse doucement le piston pour que le suc ganglionnaire s’y dépose. Il faut prendre garde à pousser doucement sur le piston pour déposer le suc ganglionnaire sur la lame : celui-ci étant souvent épais, il bouche l’aiguille et une pression trop forte risque de le faire sortir brutalement en le projetant hors de la lame.

16Une fois le suc ganglionnaire au centre de la lame, on le recouvre d’une lamelle que l’on tapote légèrement (par exemple, avec le capuchon de protection de l’aiguille pour qu’il s’étale bien). L’aiguille est jetée à la poubelle en faisant attention, lors de cette opération, à ne pas se piquer. Il est recommandé de se munir d’un dispositif spécial permettant de jeter les aiguilles sans risque.

17La lecture doit se faire immédiatement.

Lecture

18Pour lire la lame, il faut disposer d’une table bien stable (ou d’une paillasse) sur laquelle est posé le microscope, et d’une chaise à la bonne hauteur pour éviter la fatigue lors d’examens microscopiques prolongés. La lecture se faisant au grossissement 400x, le microscope doit avoir de préférence un objectif 40x et des oculaires l0x.

19La lame est placée sous l’objectif du microscope ; la lecture peut commencer dès que les mouvements de la préparation sont arrêtés.

20Les trypanosomes se voient d’autant plus facilement qu’ils sont mobiles au milieu des cellules lymphatiques. Pour conserver cette mobilité et en profiter, il faut prendre soin :

  • de ne pas mettre du désinfectant au contact du suc ganglionnaire ;
  • de ne pas avoir attendu trop longtemps avant de lire la lame ;
  • de bien appliquer la lamelle sur la lame pour étaler le suc ganglionnaire et éviter la superposition de cellules.

21La lecture doit commencer par les bords de la lamelle ; c’est là que les trypanosomes ont tendance à se regrouper (fig. 52).

Figure 52. Mode de lecture de la lame

22Si aucun trypanosome n’a été mis en évidence, on lit la lame par un balayage systématique, horizontal et vertical. Les trypanosomes n’étant pas colorés et pouvant être dissimulés entre les cellules de la préparation (hématies, leucocytes et lymphocytes), il faut être très attentif à tout mouvement dans le champ microscopique. Rappelons que le trypanosome fait environ 20 µm, c’est-à-dire, environ, la taille de trois hématies.

23Si des trypanosomes sont aperçus, le suspect est alors déclaré malade : il est inutile de pratiquer d’autres tests. Le résultat de l’examen est noté sur sa fiche individuelle ou un registre. La lame est mise à tremper dans un bocal contenant du désinfectant.

Examen direct du sang

24Il existe de nombreuses techniques de recherche des trypanosomes dans le sang. Les techniques les plus simples, mais aussi les moins sensibles, sont :

  • l’étalement frais qui consiste à rechercher directement les parasites dans du sang frais, non coloré, entre lame et lamelle ;
  • la goutte épaisse qui est une technique de coloration du sang sur lame.

25Les techniques de concentration des parasites sont plus sensibles mais plus longues et surtout plus onéreuses :

  • par centrifugation (CTC, QBC) ;
  • par filtration (mAEC).

26D’autres techniques, plus complexes, ne sont utilisées que pour la recherche scientifique et nous ne les détaillerons pas ici. Il s’agit, notamment, des cultures de trypanosomes : au lieu de concentrer les trypanosomes, on les laisse se multiplier dans un milieu de culture.

Étalement frais

27Le matériel nécessaire est rassemblé (annexe 16, p. 301). Après avoir désinfecté et piqué le doigt avec une lancette, comme décrit au chapitre « Prélèvement » (p. 141), on le maintient de telle sorte que la goutte de sang soit vers le bas (fig. 53). On place dessous une lame que l’on met en contact avec la goutte de sang afin qu’elle se dépose au milieu de la lame.

Figure 53. Dépôt de la goutte de sang sur la lame

Figure 54. Mise en place de la lamelle

28On nettoie le doigt avec du coton et de l’alcool. On recouvre la goutte de sang d’une lamelle, ce qui étale le sang en une couche mince (une seule épaisseur de cellules) (fig. 54).

29Quand il y a plusieurs personnes à prélever, il faut penser à inscrire sur la lame (sur une étiquette ou en gravant avec une pointe diamantée) les références de chacune d’elles : nom, prénoms, numéro d’enregistrement, lieu de résidence (fig. 55).

Figure 55. Identification des lames

30La lecture se fait immédiatement au grossissement 400x (comme pour le suc ganglionnaire) avant que le sang ne sèche, tant que les trypanosomes sont mobiles. Toute la surface de la lamelle est balayée pour pouvoir distinguer au moins un trypanosome, ce qui est parfois difficile (fig. 56).

Figure 56. Mode de lecture de la lame

31Cette méthode est extrêmement simple, mais c’est la moins sensible des techniques de diagnostic : pour qu’elle soit positive, il faut qu’il y ait dans le sang environ 10 000 trypanosomes par millilitre. De plus, elle est longue car on doit lire attentivement toute la lame jusqu’à la mise en évidence d’un trypanosome.

Goutte épaisse

32Le volume de sang utilisé est, pour une surface de lecture moindre, plus important que pour l’étalement frais : la technique est donc plus sensible (de l’ordre de 8 000 trypanosomes par ml). En outre, la lecture est plus aisée car les trypanosomes sont colorés.

33Après avoir piqué le bout du doigt, on procède de la même façon que pour l’étalement frais, mais on dépose 3 gouttes de sang au centre de la lame ; avec le coin d’une autre lame, on étale le sang par un mouvement tournant pour défibriner le sang (fig. 57).

Figure 57. Défibrination du sang

Figure 58. Disposition des lames sur des baguettes de verre

34Ensuite, toujours avec le coin de la 2e lame, on étale le sang pour obtenir un cercle d’un centimètre de diamètre.

35Le sang est d’abord mis à sécher à température ambiante à l’abri du soleil. La coloration se fait, sans fixation préalable, avec une solution aqueuse de Giemsa. Les lames sont ensuite posées sur les 2 baguettes de verre, sang au-dessus (fig. 58) puis colorées au Giemsa (cf. annexe 16, p. 301).

36Si on utilise une cuve à coloration, il faut prendre garde que les faces des lames sur lesquelles se trouve le sang ne se touchent pas (disposition en Z, fig. 59).

Figure 59. Utilisation d’une cuve à coloration

37Les lames sont recouvertes de Giemsa pendant 20 à 40 minutes à l’abri du soleil. Si elles sont placées sur les baguettes de verre, on fait couler le Giemsa sur les lames et on les laisse en place. Si elles sont dans une cuve à coloration, on remplit celle-ci de Giemsa de telle sorte qu’elles soient recouvertes. La coloration terminée, on rince les lames à l’eau claire sans faire couler le jet directement sur le sang coloré, ce qui risquerait de le décoller de la lame (fig. 60).

Figure 60. Rincage direct des lames

38On peut aussi les immerger dans une cuve contenant de l’eau claire (fig. 61). Après coloration, on laisse égoutter les lames en position verticale sur un portoir (fig. 62).

Figure 61. Utilisation d’une cuve pour le rinçage

Figure 62. Séchage des lames

39Les lames peuvent être conservées telles quelles dans des boîtes de rangement, en vérifiant leur étiquetage.

40La lecture se fait au microscope au grossissement 400x. Elle peut être faite immédiatement après coloration ou différée. Les trypanosomes apparaissent colorés en bleu, avec le noyau et le kinétoplaste rouges, et sont facilement visibles. Avec un peu d’expérience, on peut utiliser un grossissement moins fort.

41On peut remplacer la goutte épaisse par un frottis coloré qui consiste à faire un étalement de sang, sur lame, en couche mince et à le colorer, après fixation, au Giemsa. Le volume de sang, par champ microscopique, est moindre que pour la goutte épaisse, la sensibilité est donc plus faible. Puisque cette technique n’apporte aucune simplification technique, il faut toujours préférer la goutte épaisse.

Concentration des trypanosomes par centrifugation

42Il existe deux techniques conduisant à des résultats similaires mais dont le principe et le coût sont différents.

CTC

Principe

43La CTC ou technique de centrifugation sur tube capillaire (ou à microhématocrite, HCT des Anglo-Saxons) est également appelée technique de Woo, du nom de celui qui l’a décrite. Elle consiste à prélever du sang sur des tubes capillaires (les mêmes que ceux utilisés pour le CATT) puis, après en avoir bouché une extrémité, à centrifuger ces tubes à très grande vitesse, avec une centrifugeuse à microhématocrite.

44La centrifugation sépare les éléments du sang par force centrifuge. Les éléments les plus lourds, les hématies, se concentrent près de l’extrémité bouchée du tube (placée à l’extérieur lors de la centrifugation). L’autre extrémité du tube contient le plasma. Les globules blancs et les plaquettes forment une couche mince entre hématies et plasma ; les trypanosomes, ayant la même densité que les globules blancs et les plaquettes, se retrouvent à ce niveau.

45Cette technique ne fait appel à aucune coloration, mais nécessite une centrifugeuse spéciale et le branchement au réseau électrique ou un groupe électrogène. Le volume de sang traité, par tube, est de 60 à 70 µl. Le seuil de détection est de l’ordre de 500 trypanosomes par millilitre de sang.

Prélèvement

46On réunit d’abord le matériel nécessaire (annexe 17, p. 302). Le prélèvement est identique à celui du CATT, mais requiert deux tubes par personne. Chaque tube rempli de sang est enfoncé par une de ses extrémités dans de la pâte à scellement (cf. p. 160). Il en est retiré en le faisant rouler entre le pouce et l’index pour que la pâte qui est entrée dans le tube y demeure.

47Les tubes ne peuvent être marqués individuellement ; pour éviter les confusions on les place sur un portoir dans l’ordre d’arrivée, comme pour le CATT. On peut les placer soit verticalement, partie scellée vers le bas, sur les plaques de pâtes à sceller, dans les trous numérotés prévus à cet effet, soit directement sur le plateau de la centrifugeuse qui comporte de 12 à 36 emplacements numérotés, selon les modèles.

Centrifugation des prélèvements

48Les tubes sont placés sur le plateau de la centrifugeuse, leur extrémité obturée par la pâte en contact avec le rebord extérieur du plateau. Les tubes sont disposés de façon symétrique pour équilibrer la centrifugeuse. Si cette symétrie des tubes n’est pas respectée, l’axe de la centrifugeuse peut être faussé. Si le nombre de tubes est impair, il suffit de prendre un nouveau tube, de le remplir d’eau et de le sceller avant de le placer sur le plateau de la centrifugeuse à l’endroit où il manque un tube.

49Les tubes à centrifuger installés, on visse le couvercle du plateau et on referme celui de la centrifugeuse que l’on fait tourner pendant 5 minutes.

50Après centrifugation, on sort les tubes pour les enfoncer dans les emplacements numérotés de la plaque de pâte à sceller, en position verticale pour que les trypanosomes restent à l’interface, extrémité scellée vers le bas, en respectant l’ordre de départ. Chaque tube est soigneusement nettoyé, à la hauteur de l’interface entre les deux phases (séparation plasma/hématies, à l’endroit où doivent se trouver les trypanosomes), avec du papier toilette humide : il arrive souvent qu’à cet endroit, sur le tube, il y ait du sang gênant la lecture au microscope.

Lecture

51L’examen microscopique se fait au grossissement 200x ou 250x (objectif 20x ou 25x et non au 40x car sa profondeur de champ est insuffisante pour explorer toute l’épaisseur du tube) en milieu aqueux, c’est-à-dire que le tube doit être immergé dans de l’eau. Pour cela, on peut adopter une des deux techniques suivantes :

  • on place les deux tubes capillaires de la même personne sur une lame, dans le sens de la longueur ; on les recouvre d’une lamelle à la hauteur de l’interface. Avec une pipette, on fait couler de l’eau pour remplir le volume compris entre la lame et la lamelle ; cette technique n’est pas toujours très pratique car les tubes peuvent rouler, la lamelle basculer et l’eau s’écouler ;
  • on utilise un petit dispositif facile à fabriquer (fig. 63). On coupe un tube capillaire en trois parties égales que l’on colle, avec de l’Araldite® ou de la cyanolite dans le sens de la longueur sur une lame, en laissant entre chacun un espace suffisant pour y placer un tube capillaire. Les tubes à examiner sont placés dans ces espaces ; on recouvre d’une lamelle et on fait couler de l’eau sous la lamelle. Avec ce système, les manipulations sont faciles et plus rapides.

Figure 63. Dispositif pour l’observation au microscope des tubes capillaires

52L’examen microscopique des tubes reste délicat même pour un technicien expérimenté. La lame porte-tube est placée sous l’objectif du microscope. On centre l’objectif sur l’interface de l’un des deux tubes à lire. Les trypanosomes apparaissent animés de mouvements ondulants soit libres dans le plasma, à proximité de la couche de globules blancs, soit enfoncés dans cette couche, ce qui les rend plus difficiles à observer (fig. 64).

Figure 64. Observation des trypanosomes à l’interface hématies/plasma

53Quel que soit l’objectif utilisé, il ne peut permettre la lecture sur toute la profondeur du tube, aussi faut-il tourner le tube sur lui-même, avec un doigt, pour pouvoir examiner toute l’interface.

QBC

Principe

54Le QBC (Quantitative Buffer coat test) est basé sur le même principe que la CTC : on utilise la différence de densité entre les éléments du sang pour les séparer par centrifugation, les trypanosomes se retrouvant entre le plasma et les cellules sanguines, au même niveau que les plaquettes. Il y a, avec la CTC, deux différences importantes qui améliorent considérablement la lecture :

  • les éléments du sang sont colorés par de l’acridine orange ;
  • le tube contient un flotteur se plaçant, lors de la centrifugation, au niveau de l’interface, entre les cellules et le sérum. Les cellules et les plaquettes vont se retrouver réduites à une mince couche (40 µm) entre le flotteur et la paroi intérieure du tube, donnant ainsi une meilleure lisibilité.

55La sensibilité de cette technique est à peu près la même que celle obtenue avec la CTC, de l’ordre de 450 trypanosomes par millilitre, mais la lecture est beaucoup plus facile. Son inconvénient majeur réside dans le fait qu’il faut une centrifugeuse spéciale (type centrifugeuse à hématocrite) et un système d’éclairage par ultra-violet, matériel assez onéreux (annexe 18, p. 303).

56Le kit, fourni par le fabricant, se conserve à température ambiante (16 à 37 °C) à l’écart de toute lumière prolongée pouvant détériorer le colorant. Chaque kit se conserve environ six mois. Malheureusement, pour des raisons commerciales, le fabricant ne fournit plus ces kits. Nous espérons que ce n’est que temporaire, c’est pourquoi nous décrivons quand même cette technique.

Prélèvement

57Il se fait de la même façon que pour le CATT, mais en utilisant un tube QBC. Ce tube fait 75 mm. À 7 mm d’une de ses extrémités se trouve un trait blanc. Un deuxième trait blanc est situé à 12 mm du premier. Entre ces deux traits blancs, on placera l’étiquette d’identification du tube. Deux traits bleus, à 6 et 11 mm du dernier trait blanc, indiquent la limite de remplissage du tube (fig. 65). Cette partie du tube contient une substance anticoagulante blanchâtre. L’autre moitié du tube est d’une couleur orangée à cause de l’acridine qu’elle contient.

Figure 65. Tube QBC

58Après avoir piqué le bout du doigt (le talon chez le jeune enfant), on place au contact du sang l’extrémité du tube ne portant pas les traits blancs et bleus (fig. 66). Le sang pénètre par capillarité. On arrête le prélèvement quand l’extrémité de la colonne de sang se trouve entre les deux traits bleus, soit environ de 55 à 65 µl de sang. On peut aussi remplir le capillaire à partir d’un tube de sang (tube sec ou EDTA) prélevé au pli du coude en s’assurant que le sang n’a pas coagulé si on a utilisé un tube sec ; si le sang a décanté, on remet les éléments en suspension par un mouvement de bascule du tube. On mélange le sang avec l’anticoagulant en faisant rouler le tube QBC entre deux doigts, puis on le bascule de telle sorte que la colonne de sang descende vers l’autre extrémité. On le fait à nouveau rouler entre deux doigts pour mélanger le sang avec l’acridine orange (fig. 67).

Figure 66. Prélèvement du sang

Figure 67. Homogénéisation du sang, de l’anticoagulant et de l’acridine

59Le sang bien mélangé aux produits contenus dans le tube, on place la colonne de sang à 2 ou 3 mm de l’extrémité non marquée par les traits et on bouche cette extrémité avec un des bouchons fournis avec le kit QBC (fig. 68).

Figure 68. Mise en place du bouchon

60Par l’extrémité non bouchée, on introduit le flotteur (fig. 69).

Figure 69. Mise en place du flotteur

61On essuie soigneusement la paroi extérieure du tube avec du papier toilette humide afin d’éliminer toutes traces de sang qui pourraient gêner la lecture au microscope.

62On place enfin une étiquette entre les deux traits blancs après y avoir inscrit les informations nécessaires à l’identification du tube. Néanmoins, comme pour la CTC, il faut absolument faire correspondre l’ordre de réception des tubes et l’ordre de placement sur le plateau de la centrifugeuse car l’étiquette peut se décoller lors de la centrifugation.

Centrifugation

63Le plateau de la centrifugeuse doit être équilibré (voir CTC). Si le nombre des tubes à examiner est impair, on ajoute un tube rempli d’eau avec son bouchon et son flotteur.

64Quand tous les tubes sont en place, on revisse le couvercle du plateau et on referme la centrifugeuse que l’on fait tourner durant cinq minutes.

65Lorsque la centrifugeuse s’ouvre après l’arrêt, on dévisse le couvercle du plateau ; on place les tubes sur le portoir prévu à cet effet (il comporte 20 emplacements numérotés), en respectant l’ordre dans lequel ils ont été placés dans la centrifugeuse.

Lecture

66À l’œil nu, le tube apparaît de la façon suivante : la partie contiguë au bouchon est rouge foncé ; elle est suivie d’une partie rose puis d’une zone allant du vert au jaune et enfin d’une partie jaune transparente. À travers les zones rose, verte et jaune, on peut apercevoir le flotteur.

67On place le tube dans la gouttière du support en plastique prévu à cet effet. Le bouchon du tube se trouve à la hauteur d’une cavité du support (fig. 70).

68Une fois le tube en place, on dépose une goutte d’huile à immersion au niveau de l’interface plasma/plaquettes et on installe l’ensemble sous l’objectif Paralens 60x que l’on met en contact avec la goutte d’huile.

69On allume la lumière du générateur Parafuge relié à l’objectif par une fibre optique ; on recherche les trypanosomes dans la couche plaquettaire et dans le plasma au contact de cette couche. Il faut tourner le tube de temps en temps pour lire l’ensemble de l’interface. Au microscope (objectif 60x-lumière ultraviolette), les parties rouge foncé et rose se révèlent être composées de globules rouges (denses dans la partie rouge foncé, en couche mince entre la paroi intérieure du tube et le flotteur dans la partie rose) (fig. 71). Les zones verte et jaune sont formées dans l’ordre (en partant de la zone à globules rouges) de globules blancs, de lymphocytes et de monocytes et enfin de plaquettes. Ces différents éléments sont tous à la hauteur du flotteur. La partie jaune transparente correspond au plasma. On recherche les trypanosomes à l’interface entre plaquettes et plasma : ils apparaissent orange avec un noyau et un kinétoplaste rendus verts et fluorescents par l’acridine orange.

Figure 70. Installation du tube dans le support

Figure 71. Disposition des composantes du sang dans le tube QBC

70Il faut un peu d’expérience pour lire un QBC, mais elle s’acquiert plus vite que pour la CTC.

71Il est vivement conseillé de lire les tubes rapidement. Les trypanosomes commencent à perdre leur mobilité dans la demi-heure qui suit la centrifugation. Cette mobilité durera d’autant plus longtemps que la centrifugeuse n’a pas trop chauffé, d’où l’intérêt de la laisser refroidir de temps en temps.

Concentration par filtration : mAEC ou minicolonne

72La mAEC a été mise au point à partir d’une grande colonne de cellulose destinée à extraire les trypanosomes du sang d’animaux inoculés au laboratoire. Par la suite, cette colonne a été réduite, d’où son nom de « minicolonne », et adaptée pour le diagnostic des suspects de THA (annexe 19, p. 304).

73Cette technique permet de trouver les parasites à une concentration d’au moins 100 trypanosomes par millilitre de sang.

Principe

74La résine échangeuse d’anions (DEAE cellulose), utilisée en suspension dans un tampon phosphate (PSG), a la capacité de retenir les cellules ayant une charge électrique bien précise ; or les cellules sanguines ont une charge électrique différente de celle des trypanosomes. En adaptant le pH et la concentration du tampon, on peut retenir, grâce à la cellulose, les cellules du sang et laisser passer les trypanosomes. Selon les caractéristiques du tampon, on peut adapter la mAEC au sang humain et d’animaux. Pour l’homme, le pH est fixé à 8 et la concentration du tampon à 5 :5.

Réalisation de la mAEC

75On place le portoir sur le plateau. On ouvre le tube (vacutainer) contenant la minicolonne pour la sortir avec une paire de pinces, sans renverser le tampon. On place la minicolonne sur le portoir, pointe en bas.

76Il faut ensuite rincer par deux fois la cellulose avec du tampon phosphate (fig. 72) : avec la poire, on aspire le tampon dans le vacutainer et on en verse dans la partie supérieure de la minicolonne jusqu’à la remplir (a). On laisse s’écouler tout le tampon dans la cuvette jusqu’à ce qu’il soit arrivé au niveau de l’éponge ; on remplit à nouveau le haut de la colonne avec le tampon qu’on laisse s’écouler à travers la cellulose (b).

Figure 72. Rinçage de la minicolonne avec le tampon

77Entre-temps, le suspect a été prélevé, au bout du doigt (comme pour le CATT ou la CTC) ou au pli du coude. Le prélèvement est soigneusement identifié pour éviter tout risque de confusion. Le laborantin inscrit sur un cahier le lieu, la date et le numéro de l’examen ainsi que le nom (ou le numéro d’identification) de la personne prélevée ; le numéro de l’examen est reporté au marqueur sur les pipettes Pasteur.

78Quand le 2e rinçage de la cellulose est terminé, on place la pipette Pasteur sous la seringue et on emplit le haut de la colonne avec le sang de la personne à examiner (fig. 73 a). Ce n’est qu’après cette étape que l’on verse le glucose dans le tube ayant contenu la minicolonne. On agite bien jusqu’à dissolution totale du glucose. Le tampon phosphate est devenu un tampon PSG. Au fur et à mesure que le sang descend, on ajoute régulièrement du PSG de telle sorte que le liquide affleure le bord de la colonne (fig. 73 b).

Figure 73. Versement du sang à examiner et rinçage

79La cellulose rosit légèrement à sa partie supérieure car elle retient les cellules sanguines alors que la pipette s’emplit d’un liquide translucide. Si la colonne rosit ou rougit entièrement, il y a hémolyse ou un problème plus grave laissant passer les éléments du sang. De même, de la cellulose peut être entraînée lors de la filtration et se retrouver dans la pipette Pasteur, gênant la lecture. Ces inconvénients sont limités avec des colonnes de bonne qualité et si toutes les manipulations sont faites avec soin, à l’abri de la poussière et de l’agitation.

80On arrête la filtration quand la pipette est pleine. On la retire puis on la place dans la centrifugeuse sans retirer le cône en plastique qui protège sa pointe. On prendra soin de ne pas effacer le numéro porté sur la pipette. Par sécurité, on doit respecter l’ordre des numéros dans l’emplacement des pipettes sur le portoir, puis dans la centrifugeuse et enfin lors de la lecture.

81Quand toutes les pipettes sont en place dans la centrifugeuse et que l’on s’est assuré que celle-ci est bien équilibrée (si ce n’est pas le cas, on ajoute une pipette emplie d’eau avec son cône dans la centrifugeuse comme on a pu le faire avec un tube capillaire pour la CTC ou le QBC), on ferme le couvercle et on règle la centrifugeuse sur 1 500 tours/min pendant 5 minutes. Si on ne dispose que d’une centrifugeuse à main, on réalise seulement quatre mAEC à la fois et il faut maintenir un rythme de rotation manuelle régulier pendant 5 minutes. Il faut que les pipettes dépassent des réceptacles de la centrifugeuse. Pour cela, on les surélève avec une boule de coton enfoncée dans chaque réceptacle.

82Une fois centrifugées, les pipettes restent dans la centrifugeuse en attendant d’être lues, ou sont placées dans un porte-tubes, toujours dans l’ordre des numéros inscrits.

Lecture

83On place d’abord le système de lecture sur la platine du microscope, de telle sorte que la barre horizontale du « Τ » soit dirigée vers le lecteur.

84La pipette Pasteur est séparée très délicatement de son cône bleu protecteur en prenant bien soin de ne pas en casser la pointe effilée ; la pointe est glissée entre la lame et la lamelle, le corps de la pipette reposant sur la boule de pâte à modeler.

85Avec une poire, une pipette Pasteur ou une seringue, on remplit d’eau l’espace entre la lame et la lamelle jusqu’à ce que toute la pointe de la pipette soit entourée d’eau.

86La lecture au microscope se fait avec un objectif 10x ou de préférence 20x (si sa longueur permet de faire la mise au point). Seule l’extrémité de la pointe de la micropipette est observée.

87Avec un objectif 10x, les trypanosomes apparaissent minuscules. Ils peuvent être confondus, malgré leur mobilité, avec d’autres éléments venus souiller le milieu. Ils peuvent aussi être masqués par de la cellulose entraînée lors de la filtration. Ce problème peut être limité si la réalisation de la minicolonne a été soigneuse et si on fait tourner la pipette sous le microscope pour pouvoir observer l’intérieur de la pointe sous différents angles.

88Avec un objectif 20x les risques d’erreurs sont moindres.

Culture de trypanosomes

89Cette technique de mise en évidence des trypanosomes est lourde et onéreuse ; elle ne peut être faite que par du personnel spécialisé et, pour le moment, elle n’est utilisée que dans le cadre de programmes de recherche.

90Il existe plusieurs façons de cultiver des trypanosomes et, selon la technique utilisée, on obtiendra des formes sanguicoles ou des formes procycliques (voir le cycle du trypanosome, p. 49 et suiv.). On peut obtenir la multiplication des trypanosomes par plusieurs techniques.

Inoculation à un animal de laboratoire

91La souris est le plus souvent utilisée. L’isolement de la souche de trypanosome impose d’avoir une animalerie et d’emmener des animaux sur le terrain pour leur inoculer directement le sang du malade (prélevé sur anticoagulant) par voie intrapéritonéale. Les animaux, ramenés dans l’animalerie, sont contrôlés régulièrement par prélèvement de sang au bout de la queue et lecture entre lame et lamelle. On obtient des formes sanguicoles. L’usage de la souche isolée, pour peu que les trypanosomes se multiplient effectivement dans l’animal, dépendra du projet en cours. Le plus souvent, il s’agit d’identifications fines de la souche isolée par des techniques isoenzymatiques ou de biologie moléculaires. Cette technique est lourde, très spécialisée, mal adaptée aux conditions de travail sur le terrain lors des prospections médicales.

Xénodiagnostic

92Il consiste à faire absorber par une glossine le sang d’un malade et attendre que le trypanosome ait fini son cycle dans l’insecte vecteur. Il faut gorger plusieurs glossines ténérales pour espérer un résultat positif. Les trypanosomes obtenus en fin de cycle sont des formes métacycliques infestantes. Les glossines peuvent être contrôlées soit en sacrifiant et disséquant régulièrement quelques individus, soit en les faisant saliver sur une lame préalablement chauffée.

93Cette technique est encore plus lourde que la précédente car elle nécessite un élevage de glossines exemptes de trypanosomes. Elle a été utilisée pour la recherche de trypanosomes chez des suspects dont aucune technique parasitologique n’avait permis de mettre en évidence le trypanosome.

Culture sur milieux artificiels

94Ce mode de cultures permet de mener des études isoenzymatiques ou de biologie moléculaire et surtout de suivre la résistance au traitement de certaines souches de parasites. Il nécessite un laboratoire bien équipé, notamment d’une hotte à flux laminaire.

95Il existe plusieurs milieux permettant d’obtenir des trypanosomes sanguicoles ou procycliques, mais le KIVI (Kit for in vitro inoculation) est celui qui peut être le plus facilement utilisé sur le terrain. Plus qu’un milieu de culture, c’est un milieu de transport et de multiplication permettant de prélever une souche sur le terrain, à partir du sang du malade, et de la transporter à température ambiante jusqu’à un laboratoire équipé pour la culture des trypanosomes.

96Le kit est vendu par l’Institut de médecine tropicale d’Anvers et contient :

  • un protocole ;
  • 10 fiches individuelles d’information pour enregistrer les prélèvements ;
  • 10 tubes de culture contenant 15 ml de GLSH-DCA et des antibiotiques ;
  • du Parafilm pour obturer les flacons ;
  • 2 ml d’anticoagulant ;
  • 10 seringues et aiguilles.

97La technique est simple :

  • on prélève 9,6 ml de sang avec une seringue contenant 0,4 ml de Liquoïde (Roche, 5 %) ou d’héparine ;
  • après avoir désinfecté le bouchon du flacon d’isolement avec de l’alcool, on injecte dans le flacon, à travers le bouchon, et à proximité d’une flamme, 5 ml du sang prélevé ;
  • du fait des aléas de l’isolement (contamination, pauciparasitisme...), il faut ensemencer 2 flacons par prélèvement ;
  • une fois le sang introduit dans le flacon, on recouvre le bouchon avec un morceau de parafilm ;
  • on remplit la fiche d’information.

98Les flacons sont conservés à 15-20 °C et transportés au laboratoire de destination qui se chargera des contrôles sur les flacons d’isolement et des repiquages éventuels sur d’autres milieux de culture.

99Il existe deux principales contraintes, hormis le coût, empêchant la vulgarisation de cette technique :

  • le prélèvement et l’ensemencement doivent être menés avec une stérilité rigoureuse, sinon le milieu peut être contaminé et les trypanosomes disparaissent ;
  • le résultat n’est obtenu que deux à trois semaines après l’ensemencement du milieu, délai trop important pour adopter cette méthode dans les dispensaires ou lors des prospections médicales par les équipes mobiles.

Biologie moléculaire

100Si aucune des techniques parasitologiques n’a pu mettre en évidence des trypanosomes, on peut être amené à utiliser la Polymerase Chain Reaction (PCR) qui ne détecte pas visuellement le trypanosome dans le sang du malade mais indique la présence de son ADN. C’est donc une preuve indirecte de la présence du parasite.

101Le principe de la technique est simple. Il consiste à copier des brins d’ADN. Un fragment d’ADN est constitué de deux brins assemblés en double hélice et appariés par des liaisons énergiquement faibles que la chaleur peut scinder. Chaque brin est une succession de nucléotides (A, T, C, G) complémentaires du brin apparié (A avec T, C avec G). Si l’on scinde les deux brins pour les mettre en présence d’un petit fragment d’ADN complémentaire de l’extrémité de la région à amplifier (amorce génomique) et d’une enzyme (ADN polymérase) capable de copier, à partir d’un brin, son brin complémentaire, on obtient un nouveau fragment d’ADN. Techniquement, on place dans un tube le fragment à copier, les amorces, les nucléotides nécessaires et l’ADN polymérase. Le tube est mis dans une machine qui va réaliser des cycles d’amplification grâce à trois étapes de chauffage répétées une quarantaine de fois. La réplication est exponentielle. À partir d’un fragment d’ADN, on peut en obtenir 1 milliard ! Il devient alors très facile de mettre en évidence cet ADN par électrophorèse, alors que cela n’était pas possible avec quelques fragments. En fait, la principale difficulté réside dans le choix et la réalisation des amorces créées pour amplifier un fragment déterminé (et donc préalablement identifié) spécifique de ce que l’on recherche. Les amorces sont au nombre de 2 : une complémentaire de l’extrémité de la région à amplifier et qui sera le point de départ de la réplication, l’autre complémentaire d’un fragment situé de 50 à 2 500 nucléotides plus loin qui permettra de stopper la réplication. Dans le cas de la maladie du sommeil, ce fragment est spécifique de T. brucei sl. La PCR sera positive si l’échantillon à tester contient de l’ADN de T. brucei sl. et négative si l’ADN a une autre origine (T. congolense, par exemple) ou s’il n’y a pas d’ADN.

102La PCR est la plus sensible des techniques diagnostiques puisqu’elle permet de mettre en évidence 1 trypanosome dans 1 ml de sang. Les prélèvements de sang sur le terrain et leur transfert vers un laboratoire de biologie moléculaire, même éloigné, sont aisés. Le prélèvement se fait dans des tubes type « venoject » ou « vacutainer » contenant de l’EDTA. Ceux-ci sont conservés et transportés à + 4 °C. Son seul défaut réside dans le fait qu’elle oblige à envoyer les prélèvements de sang dans un laboratoire spécialisé. Les résultats étant différés, on se heurte au problème de retrouver les personnes prélevées.

103On a objecté que cette technique n’était pas assez spécifique puisqu’elle utilisait des sondes génomiques identifiant aussi bien T. b. brucei que T. b. gambiense ou T. b. rhodesiense. C’est un faux problème car T. b. brucei ne se développe pas chez l’homme. Si l’ont veut écarter l’éventualité d’une contamination transitoire par cette sous-espèce, il suffit de faire une nouvelle PCR à un mois d’intervalle.

104À l’heure actuelle, elle est utilisée pour le suivi des suspects.

Table des illustrations

Légende Figure 49. Position de l’aiguille
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Légende Figure 50. Prélèvement du suc ganglionnaire
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Légende Figure 51. Dépôt et étalement du suc ganglionnaire sur la lame
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Légende Figure 52. Mode de lecture de la lame
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Légende Figure 53. Dépôt de la goutte de sang sur la lame
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Légende Figure 54. Mise en place de la lamelle
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Légende Figure 55. Identification des lames
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Légende Figure 56. Mode de lecture de la lame
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Légende Figure 57. Défibrination du sang
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Légende Figure 58. Disposition des lames sur des baguettes de verre
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Légende Figure 59. Utilisation d’une cuve à coloration
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Légende Figure 60. Rincage direct des lames
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Légende Figure 61. Utilisation d’une cuve pour le rinçage
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Légende Figure 62. Séchage des lames
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Légende Figure 63. Dispositif pour l’observation au microscope des tubes capillaires
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Légende Figure 64. Observation des trypanosomes à l’interface hématies/plasma
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Légende Figure 65. Tube QBC
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Légende Figure 66. Prélèvement du sang
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Légende Figure 67. Homogénéisation du sang, de l’anticoagulant et de l’acridine
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Légende Figure 68. Mise en place du bouchon
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Légende Figure 69. Mise en place du flotteur
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Légende Figure 70. Installation du tube dans le support
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Légende Figure 71. Disposition des composantes du sang dans le tube QBC
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Légende Figure 72. Rinçage de la minicolonne avec le tampon
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Légende Figure 73. Versement du sang à examiner et rinçage
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© IRD Éditions, 2005

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