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Manuel de lutte contre la maladie du sommeil

 | 
Claude Laveissière
, 
Claude Penchenier

Partie III. Le dépistage et le diagnostic

Tests sérologiques

Texte intégral

PRÉLÈVEMENTS

Sensibilisation - Information

1Les premières personnes à recevoir l’information sont les autorités administratives qui pourront apporter leur caution et leur soutien : préfets, sous-préfets, maires, directeurs régionaux de la santé, médecins-chefs, etc. Il est utile d’informer les directeurs régionaux de l’éducation publique, les industriels, les chefs religieux, toutes les personnes pouvant intervenir auprès d’une catégorie socioprofessionnelle ou d’une communauté.

2Habituellement, la réaction immédiate de la population vis-à-vis des prélèvements est le refus. Ce refus, selon les régions et les mentalités, est dicté (entre autres raisons) par :

  • des superstitions (le sang prélevé pourrait être utilisé à d’autres fins que médicales) ;
  • la crainte d’une infection qui pourrait être causée par du matériel souillé ;
  • l’appréhension que le test ne soit pas seulement destiné au dépistage de la THA (le sida, par exemple) ;
  • la croyance que le prélèvement d’une quantité trop importante de sang ne fatigue la personne ou un interdit religieux concernant la prise de sang, etc. ;
  • la peur de la piqûre au doigt ;
  • la non-compréhension de l’intérêt du test de dépistage trypano (« je suis en bonne santé, inutile de me faire examiner » est l’excuse la plus courante).

3La sensibilisation doit d’abord être faite au village par l’infirmier accompagné si possible du coordonnateur national (ou régional). Il est souhaitable de réunir les autorités villageoises, les représentants des associations, les notables, les instituteurs et le maximum de personnes indépendamment de l’âge ou du sexe. Les enfants comme les femmes peuvent aussi bien, sinon mieux que les hommes, faire passer un message au reste de la population qui n’a pu assister à la réunion.

4Un maximum de personnes, de toutes origines, sociales et ethniques, de tous sexes, de tous âges, doivent assister à la sensibilisation, pour transmettre l’information à la famille, au groupe.

5Tout doit être expliqué en détail, mais simplement, en évitant les termes trop techniques ; l’accent doit être mis sur le risque causé par la THA (gravité, difficultés du traitement) sans engendrer l’affolement. Après avoir exposé les grandes lignes du schéma épidémiologique de la maladie (surtout sur les modalités de la transmission, le rôle de la tsé-tsé, etc.), il faut mettre en évidence l’intérêt de la lutte contre cette maladie ; il faut bien préciser que la THA ne touche pas que les étrangers ou que les hommes, mais que tout le monde, femmes et enfants, est soumis au même risque.

6Après sensibilisation, la population doit avoir compris qu’un seul malade au village peut, involontairement, être à l’origine d’autres cas ; certains pouvant être mortels en l’absence de dépistage, de diagnostic, donc de traitement.

7On doit rassurer les villageois sur l’innocuité du prélèvement et surtout sur le fait que ce test n’est destiné qu’au dépistage de la THA.

Choix des préleveurs

8Les prélèvements pour les tests sérologiques sont simples et ne nécessitent pas une formation très spécialisée, mais de la minutie, de la patience et des précautions d’hygiène.

9Ils peuvent être effectués par toute personne sachant au moins lire et écrire et ayant une bonne capacité de travail : agents recenseurs, ASC, infirmiers, etc. Nous pensons que le meilleur rendement est obtenu, comme pour le recensement, avec des personnes issues de la région et même, si possible, du village, c’est-à-dire des personnes connues et connaissant tout le monde, parlant la langue du pays et au fait des coutumes locales. Ce travail prenant un peu de temps, il faut identifier deux personnes par village : l’une peut remplacer l’autre en cas d’indisponibilité ; les deux peuvent travailler mieux et plus vite ensemble.

10Dans les pays à fort taux d’immigration, il est souhaitable que le couple de préleveurs soit constitué d’un autochtone et d’un allogène issu du groupe le plus important.

11La sélection des agents préleveurs répond au même critère que celle des agents recenseurs. Il est souhaitable d’ailleurs que les mêmes fassent le recensement puis le prélèvement, comme par exemple des ASC.

Technique de prélèvement (pour le micro-CATT)

12Ce chapitre s’adresse plus particulièrement aux non-professionnels de la santé : les infirmiers s’informeront seulement sur les techniques spécifiques préalables au test lui-même pour assurer un bon encadrement des préleveurs.

Préparation du matériel

13Avant le prélèvement l’agent doit s’assurer qu’il dispose de tout ce qu’il lui faut comme matériel et produits (annexe 5, p. 286), ainsi que le registre de prélèvements (annexe 6, p. 287). Il prépare une table bien stable et propre, éventuellement recouverte d’une nappe, et deux chaises qu’il installe à l’ombre (arbre, auvent) en évitant les endroits trop obscurs (intérieur de maison) ou trop poussiéreux.

14Si les lancettes sont neuves, il découpe des étuis à l’avance en laissant les lancettes à l’intérieur (ne déchirer l’étui qu’au moment de la piqûre). Si les lancettes ont déjà servi une fois, il place dans une coupelle émaillée un lot de lancettes qu’il arrose d’un peu d’alcool auquel il met le feu. Une fois le feu éteint, il pose sur la coupelle (refroidie) un tampon de coton légèrement humecté d’alcool.

Appel des personnes

15Si le village dispose de deux agents, l’un se consacre au prélèvement, l’autre à l’enregistrement.

16Il est préférable d’appeler les personnes, famille par famille, en suivant l’ordre d’enregistrement sur le registre de recensement.

17Les agents essaieront de canaliser la population pour éviter toute bousculade.

18Opérer dans de bonnes conditions permet de travailler vite et limite le nombre de personnes qui partent, lassées d’attendre.

Enregistrement

19Pour chaque personne qui se présente, il faut noter sur la languette au stylo à bille et non au crayon à papier (fig. 17) :

  • le numéro du prélèvement ;
  • la date du prélèvement ;
  • le nom complet de la personne ;
  • son sexe et sa date de naissance ;
  • le nom du village ;
  • son numéro de recensement.

20Ce travail est fastidieux, mais l’expérience montre qu’il permet d’éviter un nombre important de confusions lors des analyses de laboratoire.

21Toutes ces informations sont reportées sur le registre de prélèvements (annexe 6, p. 287). Sur le registre de recensement, on coche au crayon le nom de la personne qui va être prélevée.

22La languette, une fois remplie, est tendue au préleveur, ou posée sur une surface propre (feuille de papier, couvercle de l’une des boîtes, etc.).

Figure 17. Présentation de la languette de prélèvement

Prélèvement

23Le préleveur, assis à côté de la table, fait venir devant lui la personne qui reste debout. Sa main se trouve ainsi dans une bonne position à la fois pour la piqûre et pour l’imprégnation de la languette.

24Pour un nouveau-né ou un très jeune enfant, la mère le garde dans ses bras.

25Le prélèvement se fait à la pulpe du majeur ou de l’index. Si, dans certains cas, la peau de la personne est trop dure pour être correctement piquée, on peut utiliser le lobe de l’oreille. Chez le bébé, il se fait au pouce du pied ou au talon.

26L’agent utilise un tampon de coton imbibé d’alcool et essuie soigneusement le point de piqûre (fig. 18). Il prend une lancette dans la main droite. De la main gauche, il tient fermement le doigt à piquer et pique d’un coup bref, ni trop léger, ni trop appuyé, surtout chez les jeunes enfants (fig. 19).

27La lancette est ensuite plongée dans un bain désinfectant avant d’être stérilisée (fig. 20).

Figure 18. Prélèvement de sang sur une languette : nettoyage du doigt

Figure 19. Prélèvement de sang sur une languette : ponction du doigt avec la lancette

Figure 20. Prélèvement de sang sur une languette : désinfection de la lancette

Figure 21. Prélèvement de sang sur une languette : pression sur le doigt pour faire couler le sang

Figure 22. Prélèvement de sang sur une languette : dépôt de sang sur la languette

Figure 23. Prélèvement de sang sur une languette : stockage des languettes

28Après piqûre, le doigt de la personne est tourné vers le bas (pour éviter de se souiller avec le sang). Une légère pression ou un mouvement de va-et-vient sur le doigt fait apparaître une goutte de sang (fig. 21).

29Le sang est étalé sur la languette. Il faut qu’au moins le tiers de la languette soit imprégné (fig. 22).

30Cette opération peut être difficile chez le bébé, aussi est-il préférable d’imprégner correctement une petite surface que d’étaler trop largement le sang sur la languette. Lorsque l’afflux de sang est suffisant, on imprègne la languette des deux côtés. La languette est ensuite fixée sur le portoir (fig. 23) en faisant attention qu’elle ne touche pas d’autres prélèvements ou que le sang ne goutte pas sur les languettes placées en dessous. Le séchage de la languette de prélèvement doit se faire à l’ombre et jamais au soleil. Il faut aussi veiller à ce que les mouches ne viennent pas se poser sur les prélèvements.

31Un tampon d’alcool est placé sur le point de piqûre et la personne peut s’en aller. On appelle la suivante.

Rangement du matériel

32À la fin de la séance de prélèvement, lorsque les languettes sont bien sèches, on les range (sans les froisser) dans le bocal étanche contenant le dessiccateur.

33On nettoie et stérilise les lancettes (fig. 24' et annexe 8, p. 289). On range le registre dans une chemise plastifiée. Tout le matériel est replacé dans une boîte ou un carton.

Précautions- Hygiène

34Quiconque travaille sur la santé se doit d’être soucieux de sa tenue et très pointilleux en matière de sécurité.

La tenue de l’agent

Toutes les opérations durant lesquelles on manipule du sang nécessitent le port de gants en latex pour des raisons d’hygiène et de sécurité.

35Le port de la blouse est un élément rassurant la personne qui se présente au prélèvement. L’agent qui assure le prélèvement devra soigneusement se laver les mains, avant et après son travail, avec de l’eau propre et du savon. En cours de prélèvement, il doit avoir à côté de lui un seau d’eau propre pour se rincer ou laver la main d’une personne ayant trop saigné.

Figure 24. Nettoyage du matériel de prélèvement et prélèvement

Le comportement de l’agent

36Par respect pour les personnes convoquées ainsi que pour des raisons d’hygiène et de sécurité, les agents ne devront ni boire, ni manger pendant leur travail. Il est donc conseillé de se restaurer avant le début de l’opération. Il est préférable que le travail ne soit pas interrompu tant que des personnes se présentent.

37En toutes circonstances, l’agent doit rester patient et poli avec les personnes : pour beaucoup de villageois, même s’ils ont accepté de se présenter, le prélèvement est une obligation mal supportée. On évite donc toute moquerie ou signe d’exaspération.

38En cas de contestations ou de vives discussions, il devra s’en remettre à l’arbitrage de l’autorité villageoise.

Le registre de prélèvements et sa tenue

39Le registre de prélèvements est un cahier où doivent être consignés tous les renseignements concernant la personne prélevée et le prélèvement. En annexe 6, p. 287, nous donnons une description et le mode de fabrication de ce registre.

40Il est indispensable que ces renseignements soient inscrits en double : l’original reste avec l’agent, le double est expédié au laboratoire. Pour ne pas avoir à recopier, il suffit de glisser sous la feuille en cours de remplissage, une feuille de papier blanc et par-dessus celle-ci, une feuille de papier carbone.

41Chaque feuille du registre doit porter le nom du village pour que ce dernier soit porté sur le double. On note successivement :

  • la date du prélèvement, dont les numéros doivent se suivre d’une séance, d’un jour ou d’une enquête à l’autre pour éviter les confusions ;
  • le numéro d’ordre ;
  • le nom complet de la personne ;
  • le sexe et l’année de naissance ;
  • le village ou hameau de résidence ;
  • le numéro de recensement.

Expédition des prélèvements

42Une languette ne doit pas rester plus de 4 ou 5 jours à température ambiante dans le bocal étanche.

Figure 25. Préparation des languettes pour leur expédition au laboratoire

43Quel que soit le nombre de languettes, elles doivent être expédiées au laboratoire d’analyse avant cette limite. Au-delà, le résultat du test ne sera pas valable.

44Les languettes sont sorties du bocal puis mises en paquet en alternant côté sang/côté écriture (fig. 25). Le paquet est ensuite emballé dans une feuille de papier pelure sur laquelle sont marqués le nom du village, celui de l’expéditeur et la date d’envoi. Le paquet est mis dans une poche en plastique avec les feuilles d’enregistrement correspondantes. Le sachet est fermé hermétiquement par un nœud.

45Tous les moyens pour faire parvenir le sachet au laboratoire sont acceptables, à condition que le transporteur soit fiable et que les languettes ne soient pas trop longtemps laissées à la température ambiante. Il peut s’agir :

  • de l’agent lui-même ;
  • d’un parent ou d’un villageois allant au marché de la ville ou du village où se tient le laboratoire ;
  • d’un infirmier en tournée dans les villages ;
  • d’un transporteur de marchandises ou de personnes ;
  • de fonctionnaires en tournée, etc.

RÉALISATION DU MICRO-CATT

46Le micro-CATT est un test sérologique de masse destiné à évaluer le taux de séroprévalence dans une région endémique ou supposée telle. Du fait des erreurs possibles, il est préférable de l’effectuer sur le plus grand nombre de personnes possible, au minimum sur 10 % de la population totale recensée, dans les différents types d’habitats et parmi toutes les catégories socioprofessionnelles et tous les groupes ethniques.

Procédures de terrain

47Le micro-CATT, comme tout prélèvement de sang, ne s’improvise pas : il est nécessaire que les agents préleveurs reçoivent des consignes pour informer la population, pratiquer ces prélèvements de façon systématique et efficace, enregistrer correctement les données et transmettre le tout au laboratoire.

48La liste du matériel nécessaire est précisé dans l’annexe 9, p. 290.

Procédures au laboratoire

Réception et conservation des languettes

49Dès la réception des prélèvements, ceux-ci doivent être stockés dans un réfrigérateur, toujours emballés dans le sac plastique. Ils pourront se conserver au maximum trois semaines avant d’être analysés.

Préparation du test

50Pour réaliser le micro-CATT, il faut, dans chaque languette, découper cinq rondelles (ou confettis). Pour cela, on doit disposer du matériel suivant :

  • perforatrice de bureau ;
  • plaques à microtitration, propres et sèches (alvéoles à fond rond de 300 à 370 ml) ;
  • pince fine ou aiguille ;
  • feuilles d’analyse (cf. annexe 10, p. 294).

Figure 26. Préparation de la plaque à microtitration

51Les plaques comportent 8 rangées de 10 alvéoles. Les rangées et colonnes seront marquées avec des lettres et des chiffres à l’aide d’un stylo feutre indélébile (fig. 26). Les deux dernières colonnes ne servent pas.

52Avec la perforatrice, on doit découper 5 rondelles de 5 mm de diamètre. Il est important de respecter cette norme : avec des confettis plus petits, la quantité de sang est moindre et le résultat du test peut être faussé.

53En premier lieu, on prépare la feuille d’analyse (cf. la fabrication en annexe 10, p. 294). Pour cela, on note la date de l’analyse et le nom du village de prélèvement. Sur cette feuille, chaque case correspond à une alvéole de la plaque à microtitration.

54Les languettes sont sorties du sachet plastique et posées sur une surface propre et sèche.

55Les confettis sont prélevés dans chaque languette, en veillant à ce que la découpe se fasse exactement dans le prélèvement de sang et que les confettis soient bien circulaires. Il faut vérifier que les renseignements portés sur la languette correspondent à ceux de la feuille de prélèvement que l’on a devant soi en permanence.

56Les confettis sont mis dans une alvéole de la plaque à microtitration avec la pince fine ou en les piquant avec l’aiguille. On reporte sur la feuille d’analyse, à l’emplacement exact de l’alvéole, le numéro d’ordre de la languette.

57Pour faciliter les opérations ultérieures, on ne met des confettis que dans 10 alvéoles consécutives d’une même ligne.

58Les languettes sont remises dans le sachet plastique avec les feuilles de prélèvement et rangées dans le réfrigérateur. En cas de doute ou d’erreur, elles seront utilisées pour faire un nouveau test.

59Le couvercle de la plaque est remis en place et le tout est placé au réfrigérateur en attendant l’opération suivante : la plaque ainsi fermée peut rester 24 heures avant l’analyse.

Réalisation du test

60Pour le test lui-même il faut le matériel décrit dans l’annexe 11 (p. 295).

61Avec une micropipette, dont les embouts sont changés et plongés dans un bac désinfectant entre deux prélèvements, on verse 75 µl de tampon PBS dans chaque alvéole ; la plaque est mise à incuber à l’air ambiant (avec couvercle) durant 30 minutes. Puis, 8 µl de l’éluat sont déposés sur une plage d’une lame multitests ; on y ajoute 8 µl de réactif CATT.

© IRD / C. Laveissière
Photo 8. Agitateur rotatif

62Les embouts plastiques seront soigneusement lavés, rincés et mis à sécher avant toute nouvelle utilisation. Tout embout dont l’extrémité est endommagée est jeté.

63Les lames multitests comportent 10 plages et les plaques à microtitration 8 rangées de 12 alvéoles. Puisqu’on n’utilise pas les deux dernières, chaque alvéole d’une rangée correspond à une plage de la lame.

64La solution est soigneusement mélangée avec une tige en plastique fournie avec le réactif et essuyée avec du papier toilette entre deux plages.

65La lame est passée 5 minutes sur l’agitateur rotatif (électrique ou mécanique) réglé sur 70 t/min. Pour faciliter la lecture, on glisse une feuille de papier blanc sous les lames si le plateau de l’agitateur n’est pas blanc (photo 8).

66Après lecture, les plaques à microtitration sont mises à tremper dans un bac de nettoyage contenant de l’eau savonneuse. Les confettis sont extraits avec une petite tige pointue. Les plaques sont rincées et mises à sécher. Elles seront ensuite essuyées avec un tampon imbibé d’alcool puis rangées dans leur boîte d’origine.

Numérotation des tests

67Le nombre de tests impose une démarche très rigoureuse entre le moment où on découpe les confettis et le moment de la lecture. La moindre distraction peut entraîner une erreur grave. Nous reprenons ici la marche à suivre (fig. 27).

Figure 27. Numérotation et suivi des tests

68Chaque plaque porte un numéro inscrit en haut de la feuille d’analyse qui mentionne le nom du village d’où proviennent les languettes, les dates du prélèvement et de l’analyse.

69Chaque alvéole de la plaque correspond à une case de la feuille d’analyse. La série des cinq confettis découpés dans la lre languette est déposée dans l’alvéole Al de la plaque à microtitration. On note le numéro de la languette sur la feuille d’analyse dans la case correspondante : chacune des 80 cases de la feuille correspond à une alvéole de la plaque. Par sécurité, on peut noter en plus le sexe et l’année de naissance de la personne prélevée.

70Les confettis suivants seront successivement placés dans les alvéoles de la même rangée et les renseignements inscrits dans le même ordre sur la feuille d’analyse.

71On continue ainsi jusqu’à la dernière rangée.

72Après 30 minutes d’élution, on prend une lame multitests sur laquelle on inscrit le numéro correspondant à celui de la feuille d’analyse et à une rangée d’alvéoles de la plaque à microtitration en cours d’analyse : par exemple, la lame 7/4 portera les élutions de la 4e rangée de la plaque à microtitration n° 7 (feuille d’analyse n° 7).

73L’éluat de la lre alvéole (A4-plaque n° 7) est déposé sur la lre plage de la lame – en haut et à gauche – ; celui de l’alvéole B4 sur la plage n° 2,..., celui de la B10 sur la plage n° 10.

74Par ce système, plus simple qu’il n’y paraît, on sait à quelle plage de la lame multitests correspond chaque case de la feuille d’analyse, ce qui permet à partir du numéro du prélèvement de retrouver les coordonnées du suspect.

75En cas de séropositivité, on trace une croix rouge sur la case correspondante de la feuille d’analyse et l’on reporte le résultat sur la feuille de prélèvement.

76Les feuilles d’analyses sont ensuite classées par ordre dans une chemise ou un classeur.

Lecture

77La lecture du résultat se fait avec la loupe à main alors que les lames sont encore posées sur le plateau de l’agitateur (ne jamais les déplacer avant lecture).

78Un test positif se traduit par des agglutinats bleus généralement bien visibles (fig. 28).

79Il faut une certaine expérience pour lire les résultats, mais elle peut être acquise très rapidement. En cas de positivité douteuse, le test est fait une nouvelle fois avec le reste de sang sur la languette de prélèvement. Les lames sont plongées dans une solution de lessive ou d’eau de Javel avant nettoyage (rinçage et essuyage avec un petit tampon d’alcool).

Figure 28. Réaction positive et négative au test

Tenue du registre

80Si les analyses ont été faites dans le cadre d’une surveillance par sondage, les seuls résultats à consigner seront le nombre de tests réalisés par village et le nombre de cas positifs.

81Dans le cas contraire, l’infirmier responsable des analyses doit tenir à jour un registre où seront consignées, outre le résultat du test, les mêmes données que celles qui figurent sur le registre de prélèvement.

Utilisation des résultats

Laboratoire équipé pour le diagnostic

82Dans ce cas, l’infirmier doit convoquer les suspects pour leur faire subir des tests sérologiques pour confirmer le micro-CATT puis, le cas échéant, parasitologiques.

83Le protocole est le suivant : on effectue un test CATT suivi, quel que soit son résultat, d’une palpation ganglionnaire ; si des ganglions sont présents, ils sont ponctionnés pour une recherche de parasites ; si aucun ganglion n’est détecté, un prélèvement sanguin est effectué pour une recherche de parasite par minicolonne ou QBC.

84Il est souhaitable, pour chaque suspect non confirmé parasitologiquement, d’établir une fiche individuelle portant tous les renseignements concernant la personne ainsi que le résultat des tests successifs qu’il est amené à subir régulièrement chaque mois pendant trois mois (cf. annexe 4, p. 285).

Retour de l’information

85Dès la fin du test micro-CATT, l’infirmier doit dresser, village par village, une liste nominative des suspects portant, outre le nom, le sexe, la date de naissance, le numéro de prélèvement et le numéro de recensement pour éviter tout risque d’erreur de la part des préleveurs.

86Cette liste mentionne, de plus, la date et l’heure de la convocation. Par souci d’efficacité, l’infirmier regroupe les contrôles sur un jour de la semaine où il n’a pas d’autres tâches (comme les vaccinations) et où les villageois ont l’habitude de venir (jour de marché). Enfin, elle précise que tous les proches du suspect doivent l’accompagner pour subir les tests, même si leur test micro-CATT a été négatif.

87Cette liste est remise aussi rapidement que possible à la personne qui apporte les prélèvements au laboratoire. Un double est conservé au laboratoire.

Suivi des séropositifs

88Le suivi et l’encadrement des séropositifs relèvent des agents villageois. Ils doivent les convaincre de se rendre au plus vite au laboratoire accompagné de leurs proches. L’agent devra éviter le catastrophisme, mais insister sur le fait qu’un diagnostic précoce est gage d’un traitement moins lourd et moins onéreux.

Laboratoire non équipé pour le diagnostic

89En attendant que son laboratoire soit équipé, l’infirmier pourra convoquer les suspects pour tenter de déceler des signes cliniques évidents (ganglions, somnolence par exemple) ou, par questionnaire, mettre en évidence une association de symptômes plus « discrets » (changements de comportement + aménorrhée + faciès bouffi) ou encore des facteurs de risque (antécédents familiaux de THA).

90Si l’infirmier estime que la personne est fortement suspecte d’avoir la maladie, il devra l’adresser au centre de diagnostic le plus proche et transmettre une note à sa hiérarchie.

CATT SUR SANG TOTAL

91Le test CATT nécessite un matériel spécialisé. C’est pourquoi, il est généralement effectué par les centres de santé équipés et par les équipes de prospection.

92Il consiste à mettre en présence des antigènes de trypanosomes, constitués de trypanosomes (Trypanosoma b. gambiense) entiers et lyophilisés avec le sang de la personne à examiner. Si cette dernière est atteinte de la THA, son sang contient des anticorps spécifiques dirigés contre les trypanosomes. Au contact des antigènes du CATT, ils provoquent leur agglutination qui se traduit par des granulations à la lecture du test. Si elle n’est pas malade, son sang ne contient pas d’anticorps dirigés contre les trypanosomes et il n’y aura donc pas d’agglutination.

93Il faut noter qu’il peut y avoir de fausses agglutinations. C’est pourquoi, un suspect ne peut jamais être déclaré malade sur le seul résultat du CATT. Il faut avoir vu le parasite pour affirmer le diagnostic de THA.

94Contrairement au micro-CATT qui est un examen différé, c’est-à-dire réalisé quelques jours après le prélèvement, le CATT se fait à partir de sang frais. Il faut donc que la personne prélevée soit présente au moment de la réalisation du test.

95Les deux contraintes imposées par le CATT (équipement en matériel spécialisé dont la description est donnée en annexe 12, p. 297, et présence de la personne à tester) sont compensées par le fait que, sur le terrain, la réponse est donnée presque immédiatement (10 à 20 minutes).

Opérations successives

Reconstitution du réactif

96Tous les flacons de réactifs doivent être conservés au froid et n’être sortis qu’au moment du test. Sur le terrain, en prospections médicales, on doit avoir une glacière avec des sachets étanches contenant de la glace ou des boîtes réfrigérantes.

Figure 29. Reconstitution du réactif

97Avec une seringue, on prélève 2,5 ml de tampon que l’on introduit dans le flacon de réactif lyophilisé après avoir retiré la protection métallique du bouchon (fig. 29). On agite soigneusement pour remettre les trypanosomes lyophilisés en suspension. Une fois le réactif reconstitué, on retire le bouchon de caoutchouc que l’on remplace par le compte-gouttes fourni avec les accessoires. On pourra ainsi faire couler le réactif en goutte à goutte directement du flacon sur la carte. Un flacon de réactif permet de faire 50 tests.

Reconstitution des sérunns de contrôle

98Le CATT est livré avec des flacons de contrôle (témoin positif et témoin négatif) permettant de vérifier avant usage si le réactif est bon.

99Avec la même seringue qui a servi à reconstituer le réactif, on introduit 0,5 ml de tampon CATT dans chaque flacon de contrôle. Après les avoir bien agités, on retire les bouchons que l’on remplace par des compte-gouttes.

Vérification du réactif

100Il faut ensuite vérifier que le réactif n’est pas abîmé. Pour cela, on dépose sur deux des plages de la carte, une goutte de réactif. Dans le premier emplacement, on ajoute une goutte de témoin positif et, dans le deuxième, une goutte de témoin négatif (fig. 30). Avec une tige d’agitation, on mélange les deux gouttes du deuxième emplacement (témoin négatif), on essuie la tige avec du coton ou du papier absorbant (papier toilette) et on fait la même chose avec le premier emplacement. Enfin, on fait tourner la carte sur l’agitateur rotatif pendant 5 minutes. Il doit être réglé sur 60 t/min. Au bout des 5 minutes, l’agitateur s’arrête et on peut lire la carte. La plage contenant le témoin positif doit présenter des granulations (constituées de l’agglutination des trypanosomes en suspension par les anticorps contenus dans le sérum témoin positif, fig. 31) et l’autre mélange (témoin négatif) ne doit présenter aucune agglutination. Si le réactif est bon, on peut commencer à l’utiliser avec le sang des personnes prélevées. Sinon, il faut jeter le réactif et préparer un autre flacon.

Figure 30. Vérification du réactif

Figure 31. Tests positifs et négatifs

Prélèvement

101La seule différence avec le prélèvement du micro-CATT est le remplacement de la languette par un tube capillaire hépariné. Pour le reste, le matériel de prélèvement est identique (annexe 9, p. 290).

102Chaque personne à tour de rôle présente sa carte ou sa fiche. Le préleveur vérifie l’identité de la personne en lisant le nom à haute voix. Puis il prélève cette personne, selon la même technique que celle décrite pour le micro-CATT, p. 141.

103Après la piqûre, la première goutte de sang qui se forme est essuyée avec le coton. On ne commence à prélever qu’à partir de la deuxième goutte. Pour aider à l’écoulement du sang, il faut presser le doigt et le masser en partant de sa racine et en allant jusqu’à son extrémité.

104L’une des extrémités du tube capillaire est placée au contact de la goutte de sang qui se forme (fig. 32). Le sang pénètre le tube par capillarité.

Figure 32. Prélèvement du sang en tube capillaire

105Quand le tube est presque plein (le remplir, si possible, jusqu’à un centimètre de l’autre extrémité), il est impératif de bien agiter le tube capillaire par un mouvement lent de telle sorte que la colonne de sang glisse d’un bout à l’autre du tube (fig. 33).

Figure 33. Homogénéisation du sang et de l’héparine

106Dans le même temps, on fait rouler le tube entre deux doigts (fig. 34). Ces gestes ont pour but de bien mélanger l’héparine contenue dans le tube avec le sang afin d’éviter la coagulation.

Figure 34. Homogénéisation du sang et de l’héparine

107On place alors le tube sur le portoir, dans l’ordre des prélèvements. Ce portoir contient dix places numérotées. Tous les dix prélèvements, on transmet au laboratoire le portoir avec les cartes.

108Une fois le portoir rempli de tubes capillaires (fig. 35), le préleveur met en place le couvercle et l’apporte au laboratoire avec les fiches : celles-ci sont placées sur la table du laboratoire, dans l’ordre des prélèvements, sous le portoir pour éviter qu’elles ne s’envolent.

Figure 35. Portoir à tubes capillaires avec couvercle

Réalisation du test

109Sur le premier tube du portoir, on ajuste la minipoire (fournie avec les accessoires).

110On la presse doucement pour faire tomber une goutte de sang dans le premier emplacement de la carte (fig. 36), puis on repose le tube capillaire avec le reste du sang à sa place sur le portoir, ce qui permet d’avoir encore du sang si, par accident, la carte tombait. On fait de même avec le 2e tube dans le 2e emplacement et ainsi de suite jusqu’au dixième.

111On dépose dans chaque rond une goutte du réactif (fig. 37).

Figure 36. Dépôt d’une goutte de sang

Figure 37. Dépôt d’une goutte de réactif

Figure 38. Mélange du sang et du réactif

Figure 39. Essuyage de la tige d’agitation

112On mélange les deux gouttes déposées dans chaque rond avec la tige d’agitation.

113Le mélange se fait par un mouvement rotatif doux pour obtenir un rond régulier de 1 à 2 cm de diamètre, sans atteindre les bords du cercle (fig. 38).

114Entre deux plages, on nettoie la tige avec un bout de papier toilette (fig. 39).

115Cette étape achevée, on place la carte sur l’agitateur que l’on met en route pendant 5 minutes (à 60 t/min). La lecture des résultats se fait directement sur la plaque en respectant les normes de positivité données par le fabriquant et figurées sur le mode d’emploi fourni avec le matériel CATT.

116La positivité du test se traduit par une agglutination plus ou moins marquée. La négativité se traduit par une absence d’agglutination (fig. 40).

117On reporte alors les résultats sur le cahier (annexe 13, p. 298) et sur les cartes individuelles (annexe 4, p. 285) en prenant bien garde à respecter leur ordre.

Figure 40. Résultats du CATT

Figure 41. Élimination des tubes capillaires

118On jette dans un récipient approprié les tubes capillaires qui ont servi à faire les CATT (fig. 41) ; ce récipient sera brûlé avec le matériel de prélèvement, si possible dans un incinérateur.

119Les résultats des CATT sont ensuite communiqués au secrétariat pour y être notés. Les personnes négatives au test sont appelées et libérées après qu’on leur ait rendu leur carte ; celles des personnes positives sont conservées au laboratoire puis adressées au poste de diagnostic parasitologique pour examens complémentaires.

CATT SUR PLASMA OU SÉRUM

120Le principe est le même que celui du CATT sur sang total ; ce test, plus sensible, est utilisé pour diminuer le nombre de faux positifs (suspects sérologiques non malades). On n’utilise pas le sang total du suspect mais son sérum ou son plasma que l’on va diluer avec le tampon fourni avec le réactif CATT servant à le reconstituer.

Obtention du plasma ou du sérum

121Le plasma est le liquide transparent jaunâtre qui reste quand on a retiré toutes les cellules du sang (globules rouges et blancs, plaquettes...) prélevé sur un anticoagulant. Le sérum est le liquide transparent restant après retrait du caillot de sang prélevé sans anti-coagulant. Il existe plusieurs méthodes pour extraire le sérum ou le plasma du sang à tester.

122On peut prélever le sang dans un tube sec (sans anticoagulant) ou sur un tube contenant un anticoagulant par ponction à l’aiguille dans une veine du pli du coude. On laisse le tube décanter, ou on le centrifuge pour séparer le plasma ou le sérum des éléments cellulaires du sang. Le sérum ou le plasma ainsi obtenus sont immédiatement utilisés pour le CATT ou conservés au froid (+ 4°) dans un tube sur lequel on porte les informations nécessaires à son identification (nom ou numéro du suspect, lieu et date de prélèvement...).

123On peut prélever le sang sur un tube capillaire, comme pour le CATT sur sang total, simplement maintenu une vingtaine de minutes en position verticale pour qu’il décante (le tube capillaire contenant un anticoagulant, on obtient du plasma). Il faudra, bien sûr, en boucher l’extrémité inférieure. On utilise pour cela une cire d’obturation « Sigilum » ou « Vitrex » (Modulohm-Vasekaer 6-8 – DK-2730 Herlev, Danemark). On peut aussi utiliser, avec le même résultat, de la pâte à modeler achetée dans un magasin de jeu. En bouchant avec le doigt l’extrémité supérieure du tube capillaire, il suffit d’enfoncer l’autre extrémité dans cette pâte et de le ressortir en tournant afin qu’un peu de pâte reste dans le tube.

124On peut enfin, avec une centrifugeuse à microhématocrite, centrifuger ces tubes en prenant soin, là aussi, d’en boucher l’extrémité dirigée vers l’extérieur du plateau de centrifugation.

125Après décantation ou centrifugation, on casse le tube en deux après avoir réalisé un trait avec une pointe diamant ou une lime à ampoule buvable, à la jonction entre le plasma ou le sérum, et les cellules. On n’utilise que la partie du tube contenant le plasma ou le sérum.

Réalisation du CATT sur plasma ou sur sérum

126La technique est exactement la même que pour le CATT sur sang total ; on remplace seulement la goutte de sang (d’un volume égal à 30 µl) par 5 ml de plasma ou de sérum à l’aide d’une micropipette qui permet de prélever cette quantité de plasma ou de sérum dans le tube capillaire ou avec une pipette de type Gilson. Dans ce cas, il faut d’abord faire tomber dans une cupule d’une plaque à microtitration, par exemple, une goutte du plasma (ou de sérum) contenu dans le morceau de tube capillaire puis pipeter 5 µl. Le plasma ou le sérum est déposé sur la carte servant à réaliser le test.

127Le reste du test est en tout point identique à ce qui a été décrit pour le CATT sur sang total. La lecture se fait de la même façon mais au lieu d’avoir des granulations sombres dans du sang, on aura des granulations bleues dans un liquide bleu plus clair (à cause de la coloration du réactif).

CATT LATEX

128La différence principale entre le CATT et le CATT Latex (appelé : Latex T. b. gambiense) réside dans la nature de l’antigène utilisé. Pour ce dernier, le réactif ne contient pas des trypanosomes entiers lyophilisés mais une suspension lyophilisée de particules de latex couvertes d’antigènes de Trypanosoma b. gambiense de type antigénique LiTat 1.3, 1.5, 1.6.

129Ce test qui a été évalué à grande échelle sur le terrain est plus lourd d’utilisation, mais comme les premiers essais sont prometteurs, il est possible que bientôt il remplace le CATT. C’est pourquoi, nous en donnons ici la description technique.

130La réalisation du test proprement dit ne diffère du CATT que pour la reconstitution du réactif et pour l’utilisation du sang du suspect à tester.

Reconstitution du réactif et contrôle

131Pour la reconstitution du réactif, la procédure est la même que pour le CATT mais on utilise seulement 1 ml de tampon. On obtient ainsi un liquide laiteux.

132Pour le test de contrôle avec les témoins positif et négatif, on procède exactement comme pour le CATT.

Préparation du matériel

133Il faut avoir sur la table l’ensemble du matériel nécessaire (annexe 14, p. 299).

134Les plaques à microtitration comportent 96 alvéoles réparties en 8 lignes notées de 1 à 8 et 12 colonnes numérotées de A à L (voir micro-CATT).

135Les deux dernières colonnes de droite ne sont pas utilisées ; il est possible de les neutraliser en les recouvrant d’un ruban adhésif.

136On trace un trait au marqueur pour bien séparer la lre ligne de la 2e et la 2e de la 3e. Les autres rangées ne sont pas utilisées (fig. 42).

Figure 42. Préparation de la plaque à microtitration

137Dans chacune des 10 alvéoles des 3 premières lignes, on dépose, avec la micropipette, 30 µl du tampon PBS fourni avec le réactif (fig. 43). On peut alors s’occuper des tubes capillaires avec le sang à tester.

Figure 43. Dépôt du tampon PBS

Réalisation du test

138Le sang est prélevé de la même façon et avec les mêmes précautions que pour le CATT ; les tubes capillaires sont apportés au laboratoire (avec leur fiche d’identification).

139Les manipulations doivent être plus méticuleuses encore qu’avec le CATT normal, pour éviter les erreurs, car dans un premier temps il va falloir diluer le sang au 1/8.

140Avec la minipoire placée au bout du tube capillaire, on dépose une goutte de sang (environ 30 µl) dans la lre alvéole de la plaque (fig. 44). Le 1er tube est affecté à la lre colonne (A), le 2e tube à la 2e (B) et ainsi de suite jusqu’au 10e tube qui est affecté à la 10e colonne (J). On effectue les opérations suivantes :

  • après avoir déposé une goutte de sang dans une des alvéoles de la lre ligne (par exemple, en Al), on mélange bien le sang et le tampon avec la micropipette réglée sur 30 µl et munie d’un cône plastique ;
  • on prélève 30 µl du mélange qu’on transfère dans l’alvéole correspondante de la 2e ligne (A2) (fig. 45) ;
  • on mélange à nouveau et on transfère 30 µl du nouveau mélange dans l’alvéole de la 3e ligne (A3) (fig. 46) ;
  • on mélange encore puis on jette le cône dans le seau contenant de l’eau savonneuse. On a ainsi réalisé des dilutions jusqu’au 1/8.

141On refait la même opération pour la 2e colonne (B1 à B3) avec un nouveau cône jaune et le sang du 2e tube capillaire. On continue ainsi jusqu’à la 10e.

142Toutes les dilutions terminées, on dépose avec la pipette réglée sur 18 µl (avec un nouveau cône) une goutte de réactif sur chacune des 10 plages à fond noir d’une plaque plastifiée (fig. 47).

143Dans un deuxième temps, dans chaque plage, on dépose 18 µl de la dilution au 1/8 (3e ligne de cupules) en faisant bien attention de placer dans la lre plage, le sang dilué du 1er tube capillaire (cupule A3), dans la 2e, celui du 2e tube capillaire (B3)... et dans la 10e, celui du 10e tube capillaire (J3) (fig. 48).

144On mélange le réactif et le sang dilué, en les étalant avec la tige d’agitation, de la même façon que pour le CATT (bien nettoyer la tige avec du papier toilette entre chaque mélange).

Figure 44. Dépôt de la goutte de sang

Figure 45. Première dilution

Figure 46. Seconde dilution

Figure 47. Préparation de la plaque de réactions

Figure 48. Transfert du sang dilué sur la plaque de réactions

145On place ensuite la plaque sur l’agitateur rotatif (en remettant le couvercle pour éviter l’évaporation et la poussière) qu’on laisse tourner pendant 5 minutes à 70 tours par minute.

146Si le test est positif, des agglutinations se créent ; elles apparaissent en blanc sur le fond noir, mais la lecture reste délicate. Le fond noir de la plage est recouvert d’un liquide transparent très légèrement lactescent. Les granulations blanches sont généralement très petites : pour affirmer la positivité, il faut qu’elles soient bien visibles. Elles peuvent être uniformément réparties ou regroupées sur la périphérie de la plage noire. Leur taille et leur visibilité déterminent le niveau de positivité.

147On note les résultats de la façon suivante :

  • pas d’agglutination (négatif) (-) ;
  • agglutination à peine visible (négatif) (-) ;
  • agglutination manifeste (faiblement positif) (+) ;
  • agglutination intense (positif) (++) ;
  • agglutination presque complète (fortement positif) (+++).

148Les résultats sont ensuite communiqués au secrétariat pour y être notés. Les personnes négatives au test sont appelées et libérées après qu’on leur ait rendu leur carte ; celles des personnes positives sont conservées au laboratoire puis adressées au poste de diagnostic parasitologique pour examens complémentaires.

149La plaque à microtitration et la carte sur laquelle le test a été réalisé, sont jetées dans le seau contenant de l’eau savonneuse. On prépare une nouvelle plaque pour la série suivante de tubes capillaires.

FAUX POSITIFS – FAUX NÉGATIFS

150Tous les tests sérologiques décrits plus haut ne sont, ni sensibles, ni spécifiques à 100 %.

151Le manque de spécificité entraîne un trop grand nombre de faux positifs, c’est-à-dire des personnes dont le test est positif alors qu’ils n’ont jamais eu la THA. On peut donner à cela deux explications : soit ces personnes ont été piquées par une glossine qui leur a transmis un trypanosome d’animaux, non pathogène pour l’homme, soit elles souffrent d’une autre affection pour laquelle le test réagit positivement.

152Ces faux positifs doivent de toute façon passer les tests de diagnostic, ce qui entraîne une augmentation sensible de la charge de travail et des coûts.

153Le manque de sensibilité des tests, beaucoup plus grave, entraîne le phénomène inverse : un trop grand nombre de faux négatifs. Ces personnes ont, manifestement, la maladie du sommeil, mais sont négatives aux tests sérologiques. Les causes en sont encore mal connues ; un seul fait est certain : dans certains foyers circulent des variants antigéniques de T. b. gambiense ne réagissant pas aux tests classiques.

154Il est clair que ces faux négatifs échappent à l’étape suivante, le diagnostic. Cela revient, lors de la prospection de dépistage, à laisser en place des malades dont la santé va se détériorer jusqu’à l’issue fatale et qui, de plus, vont servir de réservoirs actifs de T. b. gambiense pour toutes les mouches tsé-tsé qui viendront se nourrir sur eux.

155Si un fort pourcentage de faux positifs n’entraîne qu’une simple augmentation du travail et donc qu’une légère augmentation des coûts, ignorer involontairement les faux négatifs, quel qu’en soit le pourcentage, équivaut au contraire à entretenir le foyer.

156La recherche tente d’améliorer les tests mais, en attendant, pour limiter ce phénomène il faut :

  • se renseigner sur l’identité des souches de trypanosomes circulant dans le foyer ;
  • effectuer plusieurs passages car certaines personnes se « positivent » au bout de quelque temps ;
  • si possible utiliser plusieurs méthodes de dépistage (par exemple, palpation ganglionnaire et CATT) ;
  • surtout, observer toutes les personnes présentes dans les files d’attente pour déceler des signes d’appel.

© IRD Éditions, 2005

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