Chapitre 10 – Écologie microbienne de la grotte de Lascaux
p. 253-260
Texte intégral
1Ce texte constitue la transcription de la communication présentée par Claude Alabouvette
2Je ne possède pas les connaissances de mes collègues du Laboratoire de recherche des Monuments historiques (LRMH) sur les grottes ornées et la microbiologie des œuvres d’art, voilà pourquoi les idées que je vais développer sont celles d’un naïf. Mon exposé présente les résultats du travail ayant été réalisé pour l’essentiel par Fabiola Bastian, chercheur contractuel financé par le ministère de la Culture via la direction régionale des Affaires culturelles d’Aquitaine.
3Grâce au Comité scientifique de la grotte de Lascaux, j’ai pu faire la connaissance du professeur Cesáreo Saiz‑Jimenez, qui possède une excellente expérience des problèmes de microbiologie dans les grottes. Nous avons beaucoup échangé, en termes d’interprétation de nos résultats notamment. Étant spécialisé en écologie microbienne du sol et de la rhizosphère, je dois avouer que je connais mal la littérature correspondant à la microbiologie des grottes ornées. Or, comme vous le savez, l’on ne peut pas interpréter correctement des résultats scientifiques si l’on ne fait pas référence aux travaux des collègues. Mon exposé s’articulera en quatre parties :
– l’identification des populations fongiques et bactériennes présentes dans la grotte de Lascaux, – l’analyse de la structure des communautés microbiennes des zones retenues dans le cadre du projet « Microbiologie-microclimat » et leur évolution au cours du temps,
– l’influence de l’anthropisation sur les communautés microbiennes recensées dans la grotte, – les pistes de réflexion pour d’éventuelles actions.
10.1 Identification des populations fongiques et bactériennes
4Le premier objectif que nous nous étions fixé était d’identifier les populations fongiques et bactériennes de la grotte et de comparer la diversité de ces populations dans les différentes zones de prélèvement. En 2001, une très importante colonisation de la grotte a été attribuée à Fusarium solani. Il ne s’agissait pas d’une introduction accidentelle, car le travail de Joëlle Dupont montre qu’il existe plusieurs phylotypes différents répartis dans les différents compartiments de la grotte. Ce développement soudain de Fusarium solani a vraisemblablement été provoqué par un changement des conditions environnementales et microclimatiques qui ont permis à des spores – peut-être présentes depuis l’origine de la grotte – de se développer sous une forme mycélienne visible et dangereuse pour la préservation des peintures de la grotte. Il a alors été décidé d’intervenir dans l’urgence et d’appliquer différents traitements qui ont stabilisé puis amélioré très nettement l’état sanitaire de la grotte. Cependant, des points de colonisation persistant, des traitements biocides à base d’ammoniums quaternaires parfois associés à des antibiotiques se sont poursuivis jusqu’en 2003, époque à laquelle nous avons effectué nos premiers prélèvements.
5Il n’existait aucune publication scientifique décrivant la microflore autochtone de la grotte de Lascaux. Il était donc indispensable d’identifier les populations de microorganismes de la grotte, car il était impossible d’imaginer que seules les trois ou quatre espèces de champignons et de bactéries les plus souvent citées fussent présentes.
6Nous avons finalement réalisé, en avril 2006, une série de prélèvements dans tous les compartiments de la grotte ; nous avons même eu la chance d’aller jusque dans le Puits du Sorcier et dans les galeries ensablées, lesquelles n’ont jamais été ni visitées ni traitées, et sont considérées comme les zones les moins anthropisées de la grotte. Dans chaque compartiment nous avons effectué plusieurs prélèvements en distinguant les zones visiblement colonisées et les zones apparemment non colonisées. Un de nos objectifs était en effet de démontrer que les zones apparemment non colonisées hébergeaient la même microflore que les zones visiblement colonisées, cette question ayant été débattue lors des réunions du comité scientifique.
7Pour identifier la microflore nous avons fait appel à deux types de méthode : l’une consiste à mettre en culture les organismes présents dans le substrat prélevé à la surface des parois, l’autre à extraire l’ADN (acide désoxyribonucléique) de ces substrats, sans passer par la mise en culture. À partir des cultures nous avons identifié les champignons sur les critères phénotypiques classiques (couleur de la colonie, présence de conidies, forme et taille des conidies, etc.) et également par extraction de l’ADN, puis clonage et séquençage. L’identification des bactéries a été faite sans passer par la mise en culture, à partir de l’ADN extrait des supports. Qu’il s’agisse des bactéries ou des champignons, l’identification moléculaire consiste, après l’extraction de l’ADN et sa purification, à amplifier la région d’intérêt puis à introduire les amplicons dans un vecteur plasmidique, lui-même transféré chez Escherichia coli. La zone d’intérêt est séquencée et l’identification, phylogénétique, se fait en comparant la séquence obtenue avec celles qui sont déposées dans les banques de données. Pour les bactéries nous avons utilisé la séquence 16S de l’ADN ribosomique, et pour les champignons la séquence 18S et également la région ITS de l’ADN ribosomique. Il n’y a aucune raison d’opposer les deux types de méthode d’identification, qui sont complémentaires.
8Les champignons que nous avons isolés et déterminés sur des critères morphologiques sont, pour l’essentiel, Fusarium, Gliocladium, Verticillium, Aspergillus et Penicillium. Quant au champignon mélanisé dominant dans le compartiment de droite, il s’agit de plusieurs espèces appartenant au genre Scolecobasidium. Cette détermination a été confirmée sur des critères morphologiques et moléculaires par notre collègue Alena Nováková, spécialiste de ce genre de champignons. On constate que Fusarium solani, responsable des colonisations intenses de 2001, est aujourd’hui très peu représenté ; il n’est plus dominant au sein des communautés fongiques. Sur la base des critères moléculaires, nous identifions un nombre d’espèces beaucoup plus élevé. Le tabl. iii présente les 10 espèces de champignons les plus représentées parmi les quelques 600 clones qui ont été analysés. Il existe donc une grande diversité de champignons présents dans la grotte de Lascaux ; les colonies visibles ne représentent heureusement qu’une faible partie de cette diversité. Le tabl. iv présente les 10 espèces bactériennes les plus représentées. Elles incluent une grande abondance de Ralstonia et de Pseudomonas, mais révèlent aussi des Legionella, bactéries souvent associées aux amibes et qui peuvent être pathogènes pour l’homme. La quasi-absence de l’espèce Pseudomonas fluorescens, décrite précédemment comme associée à Fusarium solani, peut s’expliquer par une mauvaise identification initiale, car la technique alors employée ne permet pas de distinguer Pseudomonas fluorescens d’autres espèces de Pseudomonas, alors que la méthode moléculaire le permet.

TABL. III – Principales espèces fongiques : les dix clones les plus abondants par échantillons, en nombre et en pourcentage.

TABL. IV – Les taxons bactériens les plus abondants dans la grotte de Lascaux.
10.2 Analyse de la structure des communautés microbiennes
9Qu’il s’agisse des champignons ou des bactéries, nous révélons les mêmes espèces à partir des zones visiblement colonisées et des zones apparemment non colonisées. Ces résultats renforcent l’hypothèse selon laquelle les mêmes microorganismes sont présents sur les supports, et que ce sont des facteurs environnementaux très localisés qui favorisent le développement de colonies apparentes en certains points et non en d’autres situés à proximité les uns des autres. La croissance des champignons exigeant d’une part une source de carbone organique et d’autre part des conditions climatiques favorables, ces résultats ont conduit au lancement du programme « Microbiologie-microclimat », qui a pour objectif de tenter de relier le développement microbien observé sur la surface des parois aux conditions microclimatiques mesurées également à la surface de ces parois. Ce projet fait appel aux compétences de Jean‑Didier Mertz et David Giovannacci (LRMH) pour ce qui est de la caractérisation de l’état hydrique de la roche, d’Adriana Bernardi (Istituto di scienze dell’atmosfera e del clima, rattaché au Conseil national de la recherche (Padoue, Italie) pour la mesure des paramètres du microclimat à l’interface roche/atmosphère, et de Fabiola Bastian (Inra), Geneviève Orial et Faisl Bousta (LRMH) pour le suivi de la colonisation microbienne.
10Trois zones de mesure, d’observation et de prélèvement ont été choisies à l’entrée du Diverticule axial (DA), car à l’époque où nous avons fait ce choix, cette zone était microbiologiquement très active. Les zones 1 et 2 sont contiguës sur le côté droit du DA ; la zone 1 apparaît toujours très sèche et non colonisée, la zone 2 beaucoup plus humide et partiellement colonisée. La zone 3 quant à elle est située à gauche du DA, en face des zones précédentes ; elle est caractérisée par une forte humidité et une forte colonisation fongique. Des instruments de mesure ont été spécialement fabriqués et disposés à ce niveau pour caractériser les transferts d’eau dans la roche et quantifier l’humidité, la température et les courants de convection à sa surface. Parallèlement, des prélèvements ont été réalisés, au moment de la mise en place du dispositif et dix-huit mois plus tard, pour caractériser les populations microbiennes. Les mesures montrent que la roche, à cet endroit, ne présente que des pores de très faible diamètre qui, de ce fait, sont constamment remplis d’eau. La roche ne joue pas un rôle actif dans le transport de l’eau. Les conditions microclimatiques à la surface de la roche sont plutôt conditionnées par les paramètres du climat de l’atmosphère que par ceux de la roche. Adriana Bernardi a enregistré des différences microclimatiques entre les trois zones étudiées, avec au cours du temps une stabilisation et un rapprochement des paramètres mesurés pour les zones 1 et 2, qui restent différents de ceux de la zone 3.
11Du point de vue microbiologique, nous avons mis en œuvre toutes les techniques décrites précédemment pour identifier les microorganismes présents. Les résultats montrent que certains champignons bien représentés dans les zones 2 et 3 sont absents de la zone 1, la plus sèche. Les populations bactériennes sont également beaucoup plus complexes et beaucoup plus diversifiées dans les zones 2 et 3, les plus humides. La différence affectant la diversité des populations fongiques et bactériennes peut donc être corrélée aux différences affectant le microclimat. Nous avons également fait appel à une autre méthodologie, dite T‑RFLP, qui permet d’apprécier la structure des communautés microbiennes sans avoir besoin d’identifier les espèces. De manière synthétique les résultats sont présentés sur des plans dits « d’analyse en composantes principales » (ACP). Et globalement, lorsque visuellement les éléments qui représentent la diversité de la structure des communautés apparaissent superposés sur un même plan d’ACP, cela indique que la structure de ces communautés n’est pas significativement différente, ce qui doit être confirmé ensuite par un traitement statistique. On remarque que sur ce plan d’ACP (fig. 151), les points correspondant aux prélèvements effectués en février 2007 dans les zones 2 et 3 sont superposés mais se distinguent nettement des points correspondant aux prélèvements effectués dans la zone 1. Ceci permet de conclure que la structure des communautés microbiennes de la zone 1 est différente de celles des zones 2 et 3, qui sont semblables entre elles.

FIG. 151 – Analyse en composantes principales de la structure des communautés fongiques des zones 1, 2 et 3 : a prélèvement de février 2007 ; b prélèvement de juillet 2008.
12À la suite de la réunion du comité scientifique du printemps 2008, Adriana Bernardi nous ayant fait observer que les conditions microclimatiques de la zone 2 tendaient à se rapprocher de celles de la zone 1, nous avons réalisé de nouveaux prélèvements pour analyser la structure des communautés microbiennes et détecter une éventuelle variation qui pourrait être corrélée à l’évolution des conditions microclimatiques. Les résultats montrent une évolution des communautés fongiques entre 2007 et 2008 et mettent en évidence une modification de la structure des communautés de la zone 2, qui se rapproche de celle des communautés de la zone 1.
13Ces résultats semblent donc conforter l’hypothèse selon laquelle l’évolution des communautés microbiennes est déterminée par l’évolution des paramètres du microclimat. Cependant, cette tendance n’a pu être démontrée rigoureusement. En effet, la quantité trop limitée de substrat disponible à la surface de la roche n’a pas permis de répéter les analyses. Pour permettre une analyse statistique des résultats, nous avions effectué trois prélèvements par zone, mais nous n’avions pas assez d’ADN dans chaque prélèvement pour faire des répétitions biologiques, sachant que pour chaque analyse nous pratiquons trois répétitions méthodologiques.
14Et je souhaite insister sur ce point propre au travail dans les grottes ornées : nos investigations sont limitées par la quantité de matériel disponible pour faire des analyses microbiennes. De plus, chaque fois que nous prélevons, nous détruisons l’objet de notre étude, puisque le prélèvement que nous ferons six mois plus tard ne sera évidemment pas identique au premier. Et même si nous n’avons besoin que de très petites quantités d’ADN nous sommes confrontés à cette difficulté.
10.3 Influence de l’anthropisation sur les communautés microbiennes
15Je vais enfin vous entretenir des effets de l’anthropisation de la grotte sur les communautés bactériennes. C’est sur ce point que nous avons beaucoup bénéficié de l’aide de Cesáreo Saiz‑Jimenez.
16Les populations bactériennes de Lascaux sont nettement différentes de celles identifiées dans des grottes non anthropisées. Les protéobactéries représentent 98 % des phylotypes identifiés à Lascaux, contre 45 % en moyenne dans des grottes qui n’ont pas été anthropisées. Les genres Ralstonia et Pseudomonas représentent à eux seuls 54 % des clones. Les Ralstonia et les Pseudomonas sont tout de même présents dans la zone la moins anthropisée de la grotte, celle des galeries ensablées du Puits du Sorcier. Cela s’explique aisément : les activités humaines, et en particulier les traitements, n’introduisent pas de nouvelles populations mais exercent une pression de sélection sur les populations préexistantes et permettent simplement à certains germes de se multiplier davantage que les autres. Les populations bactériennes de Lascaux comprennent de nombreuses espèces associées à des protozoaires, espèces représentatives de milieux très anthropisés comme les tours de réfrigération des grands immeubles ou les couloirs des hôpitaux.
17Immédiatement après la réouverture de la grotte, à la suite du dernier traitement biocide de janvier 2008, nous avons prélevé un peu de terre au-dessus de la banquette au fond du Passage et nous avons effectué des mises en culture dans du milieu enrichi à 1 et 5 ml/l de Dévor Mousse – qui est le mélange d’ammonium quaternaire et d’isothiazolinone utilisé pour ces traitements – et nous avons mis en évidence la croissance, même pour la concentration la plus forte, de deux Pseudomonas qui ont été déterminés comme étant Pseudomonas brenneri et Pseudomonas chlororaphis. Ce résultat n’est pas surprenant car la littérature signale que certaines espèces bactériennes sont capables de dégrader l’ammonium quaternaire. Il faut être conscient des conséquences indirectes de ces traitements biocides utilisés pour juguler les colonisations fongiques. L’incidence des traitements est confirmée par le calcul de l’indice de Shannon, qui permet de comparer la diversité de différentes populations. Celui-ci est beaucoup plus élevé dans les zones colonisées, et donc fréquemment traitées, que dans les zones non colonisées. Les traitements ont contribué à augmenter la diversité des populations bactériennes en favorisant le développement de certaines espèces peu représentées au sein des populations des zones non traitées. En ce qui concerne les champignons, les Fusarium solani qui sont isolés de la grotte sont résistants au formaldéhyde, et cela est logique étant donné le grand nombre de traitements effectués avec ce produit au cours des années passées. Il faut signaler que Fusarium se développe à partir de n’importe quelle source de carbone organique y compris l’éthanol. La colonisation par Scolecobasidium, très nettement dominant dans le Diverticule de Droite puisque nous l’avons identifié à partir de quatorze prélèvements différents, pourrait également être associée à la fréquence des traitements biocides, car ce champignon est décrit dans des publications japonaises comme capable de se développer en utilisant par exemple les détergents des laveries comme seule source de carbone et d’azote.
10.4 Pistes de réflexion
18Compte tenu de cet état des lieux, quelles sont les pistes pour assurer la préservation des oeuvres d’art de la grotte de Lascaux ? Nous avons beaucoup parlé hier d’équilibre climatique, et aujourd’hui il faut je crois parler d’équilibre microbiologique. Les microbiologistes du sol savent que toutes ces populations bactériennes et fongiques interagissent en permanence dans le sol, et les pathologistes savent aussi que l’on n’éradique jamais un agent pathogène. Il convient donc d’agir sur les équilibres microbiens pour que l’agent pathogène ne se développe pas et que son activité néfaste ne se manifeste pas. C’est, je crois, ce que nous devons tenter de faire à Lascaux. Il faut parvenir à établir un équilibre entre les populations microbiennes tel qu’il empêche la prolifération de certaines d’entre elles. Il ne s’agit pas de rétablir l’équilibre microbien d’origine, qui est perdu et qu’on ne retrouvera sans doute jamais, mais un équilibre qui doit permettre de freiner voir d’annihiler le développement des champignons dangereux pour la préservation des peintures.
19Comme en agriculture, la lutte chimique présente de nombreux inconvénients. Nous savons que les microorganismes forment à la surface des parois de la grotte des biofilms associant plusieurs espèces bactériennes et fongiques. Les propriétés de ces biofilms sont différentes de celles de chaque espèce cultivée en culture pure. Il est démontré que les mêmes espèces sont plus résistantes aux traitements biocides lorsqu’elles sont associées dans des biofilms que lorsqu’elles sont en culture pure, et on doit questionner la validité des essais de laboratoire destinés à évaluer l’efficacité de différents biocides.
20Les populations bactériennes de Lascaux comprennent plusieurs espèces dont on sait qu’elles sont associées à des protozoaires et à des champignons. Nous avons notamment trouvé une bactérie appelée Collimonas qui est mycophage, c’est-à-dire capable de se développer aux dépends des champignons ; il a d’ailleurs été proposé de l’utiliser en lutte biologique. Mais cette bactérie est également bien connue des chercheurs qui s’intéressent à la dégradation des minéraux, puisqu’elle est autochemolithotrophe, c’est-à-dire capable de se développer en tirant son énergie des minéraux. Elle peut donc être à l’origine du cycle biologique, puisqu’elle est capable de se développer très lentement sur les minéraux et à leurs dépends. Les cellules bactériennes mortes constituent alors une matière organique pouvant être utilisée par un autre microorganisme. Cet exemple montre la complexité des interactions des microorganismes entre eux et des microorganismes avec le milieu. Il convient donc d’intervenir très prudemment, toute action pouvant avoir des conséquences insoupçonnées.
21Extraire les germes qui posent problème, c’est-à-dire Fusarium solani et Scolecobasidium, de leur contexte biologique est infaisable. Il nous faut accepter la difficulté de prendre en compte la globalité des communautés microbiennes qui sont conditionnées par le microclimat, et c’est là toute la difficulté. Parmi les champignons identifiés à Lascaux figurent des espèces connues pour être véhiculées par des arthropodes – ceux-ci peuvent ingérer des spores qui, une fois expulsées, germent plus facilement dans une boîte de Petri – et d’autres espèces susceptibles de détruire les mêmes arthropodes et utilisés en lutte biologique. Là encore, l’interaction n’est pas à sens unique. Et toute intervention brutale peut avoir des conséquences imprévues. Enfin, les résidus des produits biocides peuvent représenter une source de carbone et d’azote utilisable pour les microorganismes survivants. Les résultats de ces traitements sont absolument probants, et une fois le traitement effectué, 95 % à 99 % de la microflore a été détruite. Néanmoins, ce qui reste ne demande qu’à redémarrer. Par exemple, jusqu’à un passé récent, les agriculteurs avaient le droit de traiter les sols pour les désinfecter avec une molécule extrêmement dangereuse, le bromure de méthyle. Toutefois, il leur fallait désinfecter à nouveau tous les ans, parce que le pathogène réapparaissait chaque année. Il faut donc abandonner le désir d’éradiquer les éléments qui nous gênent ; il faut simplement essayer de trouver le moyen de les empêcher de se développer et d’être néfastes.
22On s’est interrogé hier sur l’origine de la mélanine sur les parois. Estelle la même que celle qui est produite par les champignons noirs qui posent problème ? Quelle est la durée de vie de cette mélanine ? Quelle est la physiologie de ces champignons ? Quelles sont les conditions dans lesquelles ces champignons produisent de la mélanine ? Peut-on utiliser des moyens physiques tels que les rayonnements germicides pour détruire les champignons sans endommager les œuvres ? Ce sont autant de questions qui méritent d’être prises en considération. Il faut également se poser à nouveau la question des vecteurs – insectes, hommes et courants de convection – pouvant transporter les propagules fongiques, parce que les suivis d’aérocontamination effectués par le LRMH n’ont jamais permis de détecter dans l’air les champignons présents sur les parois.
23Se pose enfin la question véritablement fondamentale : comment établir ou rétablir un équilibre microbiologique qui soit favorable à la conservation des œuvres d’art ? À mon avis, cela ne sera possible que par une approche holistique et une meilleure régulation du climat. Il faut à terme que les mesures du microclimat qui concernent quelques décimètres carrés de surface de paroi, soient reliées au modèle du prototype géré par Delphine Lacanette (cf. chapitre 6). Il me semble que c’est dans cette direction qu’il faut aller.
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