Chapitre 9 – Gestion des activités biologiques à Lascaux : identification des microorganismes, contrôles, traitements
p. 219-251
Texte intégral
9.1 Introduction
1La conservation des peintures et gravures des sites naturels comme les grottes ornées est probablement le challenge le plus difficile que les responsables de la conservation du Patrimoine ont à relever. Dans ce domaine, la France possède un héritage très important et la grotte de Lascaux, reconnue Patrimoine mondial par l’Unesco, en est un des remarquables exemples. Elle est située sur la commune de Montignac (Périgord) et représente l’un des plus célèbres sites de peintures préhistoriques au monde. Mais depuis sa découverte en 1940, elle a connu plusieurs crises qui, entre autres, ont perturbé son équilibre biologique. Les premiers problèmes d’ordre biologique remontent aux années 1960 avec le développement anormal de cellules d’algues vertes sur les supports, ce qui entraîne la fermeture de la cavité en 1963. En septembre 2001, la cavité est victime d’une contamination sans précédent, par des moisissures : un duvet blanc de mycélium recouvre en quelques jours l’ensemble des sols, des banquettes latérales et une partie des plans inclinés, nécessitant un traitement d’urgence. En juillet 2007, une autre contamination, sous forme de colonisations noires, se développe plus particulièrement dans la partie droite de la grotte et oblige à la mise en œuvre d’un nouveau traitement biocide. Le Laboratoire de recherche des Monuments historiques (LRMH) assure depuis plus de trente ans le suivi des activités microbiologiques de la grotte de Lascaux grâce à des contrôles réguliers de l’état sanitaire de l’atmosphère comme des parois, et des préconisations de traitement quand cela se révèle nécessaire.
9.2 La conservation des œuvres pariétales, un problème complexe
2Toutes les cavités naturelles, quelles soient ornées ou non, représentent des systèmes ouverts, en relation constante avec le milieu environnant, interne comme externe. Les conditions environnementales, aux environs de 12 °C et 99 % d’humidité relative, sont a priori sévères pour la conservation d’œuvres peintes : l’humidité très élevée, proche de la saturation, associée aux épisodes de condensation, favorise les ruissellements et coulures de pigments. De même, la présence naturelle de gaz carbonique n’est pas sans risque pour la conservation des peintures pariétales. Les taux parfois élevés de CO2 peuvent favoriser soit les dissolutions des substrats carbonatés par formation d’acide carbonique, soit la précipitation de calcite sur les parois, avec formation de voiles translucides ou opacifiants (Brunet, Vouvé 1996).
3Si des conditions environnementales relativement stables ont permis la conservation de certaines œuvres jusqu’à nos jours, les possibilités d’action de l’homme sur le milieu pour « améliorer » les conditions de conservation des œuvres sont faibles : tout abaissement important de l’humidité relative entraînerait la dessiccation et la pulvérulence de certains pigments, et tout apport d’eau important, s’il n’est pas contrebalancé par le contrôle de la température, peut entraîner condensations et ruissellements.
4Sur le plan biologique et microbiologique, ces cavités possèdent une flore et une faune spécifique qui peuvent varier dans le temps et l’espace, en fonction des apports naturels endogènes (infiltrations d’eau…) ou exogènes liés aux activités humaines. Elles offrent des situations extrêmement propices au développement de microorganismes :
– substrats riches en eau comme les argiles et/ou présentant des surfaces très mouvementées (niches potentielles pour les microorganismes),
– présence de matière organique. La plupart du temps, les développements observés (algues, champignons, lichens) restent limités en raison d’un équilibre biologique qui s’est établi sur le long terme. Parfois, à la faveur d’événements climatiques ou environnementaux, une espèce biologique peut se développer de manière anarchique, et lorsque ce développement est initié, il est très difficile de le stopper en raison des conditions initiales très favorables (niches inaccessibles, réensemencement ; Roquebert, Orial 2002).
9.3 Le suivi sanitaire de la grotte de Lascaux jusqu’en 2000
9.3.1 Caractéristiques de la grotte
5Lascaux est une grotte de type descendant dont l’entrée se situe dans la partie sommitale de la colline. C’est une cavité de taille moyenne d’une longueur d’environ 60 m depuis la porte d’entrée jusqu’à l’extrémité du Diverticule axial et d’environ 110 m de l’entrée jusqu’au fond du Diverticule de Droite. Le volume du réseau accessible est de l’ordre de 320 m3 pour la Salle des Taureaux et 1 300 m3 pour la partie droite (Abside et Nef).
6Les parois ornées sont à une dizaine de mètres du sol extérieur et représentent 54 m2 pour la Salle des Taureaux, 100 m2 pour le Diverticule axial et 120 m2 pour la Nef et l’Abside (fig. 105). Actuellement, la température de l’air à l’intérieur de la cavité est de l’ordre de 12,5 °C et l’humidité relative est voisine de la saturation.

FIG. 105 – Paroi gauche de la Salle des Taureaux.
© D. Bouchardon / LRMH.
9.3.2 La première crise biologique des années 1960
7Le premier point d’algues vertes apparaît en septembre 1962 après douze ans de visites ininterrompues entraînant un surplus de CO2 et de lumière. Devant la recrudescence de ces développements verts et l’apparition de voiles de calcite blanche, la grotte est fermée au public en 1963, en raison de ce qui sera appelé « la maladie verte » et « la maladie blanche ». L’agent responsable de la contamination est identifié par les docteurs Lefèvre et Pochon de l’Institut Pasteur (Lefèvre, Laporte 1969 ; Lefèvre 1974) comme étant une seule algue unicellulaire faisant partie des chlorophytes et plus précisément du genre Bracteacoccus (fig. 106). En revanche les analyses des sédiments et parois révèlent l’existence d’une multitude d’êtres vivants, végétaux et animaux : bactéries, algues, moisissures mais aussi petits flagellés incolores, amibes… Les premières conclusions des scientifiques attribuent à la grotte certaines propriétés sélectives : bien qu’abondamment présents, les bactéries, champignons et algues ne se développent pas et restent à l’état de spores. Une seule espèce d’algue a été capable de s’y multiplier. La notion d’auto‑épuration est même avancée (Lefèvre 1974).

FIG. 106 – Bracteacoccus sp.
© LRMH.
8Le processus de décontamination algale est alors élaboré avec un biocide incolore et sans incidence sur les peintures. C’est une solution d’aldéhyde formique au 1/200e qui est retenue et appliquée sur la roche nue, les sols et les peintures. En quatre mois la grotte est débarrassée des algues vertes. Un traitement préventif est conseillé et mis en place sous la forme de pulvérisations locales d’aldéhyde formique sur les cheminements et la mise en place, à l’entrée de la cavité, d’un pédiluve rempli également d’aldéhyde formique et destiné à la désinfection des chaussures. Ces interventions seront poursuivies jusqu’en 1998. Il est à noter que, jusqu’à aujourd’hui, aucune algue verte n’est réapparue.
9.3.3 Le suivi microbiologique jusqu’en 2000
9Le contrôle de la pollution microbiologique est assuré jusque dans les années 1970 par l’institut Pasteur. Puis c’est le LRMH qui sera chargé du suivi sanitaire. Celui‑ci consiste en une évaluation de la pollution microbiologique – bactérienne, fongique et algale – de l’air, associée à un constat d’état visuel des surfaces accessibles.
10Pendant une vingtaine d’années, c’est la méthode « statique » qui est adoptée. Des boîtes de Petri contenant des milieux de culture spécifiques à chaque type de microorganisme sont posées au sol et laissées ouvertes 5 mn pour les bactéries et champignons, et 24 h pour les algues. Pendant cette durée, les microorganismes présents dans l’air viennent se déposer par gravité sur le milieu de culture. Le temps d’exposition terminé, les boîtes sont refermées puis ramenées en laboratoire et placées en incubation dans des conditions optimales de culture. Les germes viables et cultivables peuvent être dénombrés et exprimés en « unités formant colonies » (UFC). Une dizaine de points choisis à l’intérieur de la cavité mais également dans les sas d’entrée sont contrôlés suivant ce protocole deux fois par an jusqu’en 1990. Les taux de germes présents dans l’air varient, à l’époque, dans des fourchettes très basses, de 0 à 5 UFC pour les moisissures et de 0 à 15 UFC pour les bactéries. Les résultats montrent que la pollution tant algale que bactérienne diminue spontanément si les visites sont suspendues, phénomène évoquant la réelle faculté d’auto‑épuration de la grotte.
11À partir de 1990 la procédure est modifiée et passe à la méthode dite « dynamique ». Les milieux de culture restent les mêmes que pour la technique statique mais les boîtes de Petri remplies de milieux de culture gélosés sont placées, ouvertes, dans une sorte d’aspirateur. Pendant le temps d’aspiration, les microorganismes, transportés dans l’air aspiré, viennent s’impacter sur la gélose. L’opération d’aspiration, qui dure quelques secondes, est renouvelée pour chaque type de microorganisme avec le milieu de culture adéquat. Les boîtes sont ensuite refermées et ramenées en laboratoire pour la mise en incubation puis la numération des colonies. Le volume d’air aspiré étant connu, le nombre d’UFC peut être rapporté au mètre cube d’air (fig. 107‑109).

FIG. 107 – Prélèvement d’air dans le Diverticule axial.
© LRMH.

FIG. 108 – Appareil SAS Compact.
© LRMH.

FIG. 109 – Exemple de culture sur milieu après prélèvement d’air et incubation
© LRMH.
12En contrôle dynamique, le niveau de base est plus élevé mais se situe toujours dans des fourchettes basses, entre 0 et 50 UFC/m3 pour les moisissures et entre 0 et 150 UFC/m3 pour les bactéries. Cette méthode dynamique est toujours utilisée aujourd’hui et, pour une reproductibilité des résultats, le protocole reste identique à chaque campagne de mesures : appareillage, milieux de culture, temps d’aspiration et localisation des points de prélèvement.
13La pollution détectée dans l’air est principalement liée aux mouvements et activités humaines. Celle qui peut être constatée sur les supports est en général plutôt associée à un développement de germes telluriques. Il faut souligner que l’accumulation des polluants aériens intensifie, en se déposant, le biofilm de surface, créant ainsi des niches favorables à l’émergence d’autres microorganismes telluriques.
14Quelques déséquilibres sans gravité sont parfois constatés – par exemple au moment de la réalisation de la copie en 1973. Toutefois, grâce à une limitation du nombre de visiteurs (5 par jour) et à un éclairage diffus, l’équilibre de l’écosystème est maintenu, et jusqu’en 1994 aucune manifestation visible microbienne n’est détectée dans la cavité. À ce moment, un premier petit dépôt d’origine fongique apparu dans la cavité est mentionné par les agents de surveillance sur le sol de la Salle des Taureaux. C’est à partir de cette période également que les pollutions aériennes deviennent fluctuantes, avec des pics parfois importants mais aussi avec des retours réguliers aux niveaux de base. Il faut être conscient qu’aucune référence n’est disponible dans ce type de surveillance. Chaque grotte ornée, suivant sa taille, son volume, ses échanges avec le milieu environnant, va avoir sa « carte d’identité microbienne » propre, une sorte de « bruit de fond » biologique naturel mais également une capacité à « accepter » ou « supporter » un certain degré de pollution exogène. On peut parler en quelque sorte d’une auto‑épuration ou d’une régulation avec un seuil limite : en deçà de ce niveau, l’équilibre persiste, au‑delà, il peut y avoir perturbation sous forme de manifestations visibles biologiques. Le problème réside dans notre méconnaissance des limites a priori acceptables, spécifiques à chaque cavité.
15Pendant plus de trente ans la cavité ne montrera aucun signe inquiétant de perturbation, et malgré l’apparition sporadique de dépôts biologiques et la variabilité de l’aérobiocontamination liées à une plus grande fréquentation de la cavité, rien ne pouvait laisser supposer la brutale et massive contamination fongique de la fin 2001.
9.4 La contamination de 2001 et sa gestion
16En septembre 2001, après la campagne de travaux de réfection du système de gestion de l’air, la cavité est victime d’une contamination sans précédent, par des moisissures : un duvet blanc de mycélium recouvre en quelques jours l’ensemble des sols, des banquettes latérales et une partie des plans inclinés. Le développement apparaît d’abord dans le sas 2, atteint ensuite la Salle des Taureaux et le Diverticule axial pour enfin gagner toute la Nef (fig. 110‑112).

FIG. 110 – Développement de mycélium blanc sur une banquette.
© LRMH.

FIG. 111 – Détail des colonisations blanches sur une écaille de roche.
© LRMH.

FIG. 112 –Aspect des colonisations sur le sédiment argileux.
© LRMH.
9.4.1 L’identification
17La souche responsable de la contamination est identifiée comme Fusarium solani, espèce tellurique à spores humides enveloppées dans un mucus hydrophile et véhiculées par l’eau. Cette espèce dont l’activité en eau (aw) est élevée (> 0,9) est très commune dans les sols et connue dans le domaine agricole pour être responsable de la maladie des plantes appelée « fusariose » (fig. 113).

FIG. 113 – Vue microscopique de Fusarium solani (G x 400).
© LRMH.
18Les examens, à la loupe binoculaire et en microscopie électronique à balayage, de petites écailles de roche prélevées sur site et colonisées par le Fusarium montrent l’intensité du recouvrement mycélien et la profondeur de pénétration des hyphes dans le substrat (fig. 114, 115). Ces observations permettent également de mieux comprendre les dégradations physiques que peuvent induire les moisissures sur les supports colonisés, sans oublier les altérations chimiques liées aux sécrétions métaboliques comme les acides organiques.

FIG. 114 – Aspect à la loupe binoculaire de la surface colonisée d’une écaille de roche.
© LRMH.

FIG. 115 – Vue en microscopie électronique à balayage de la même écaille : visualisation de la pénétration des filaments mycéliens dans le substrat.
© LRMH.
19Seule une intervention immédiate pouvait éviter une propagation de la colonisation aux peintures elles‑mêmes et les risques évidents pour leur conservation.
9.4.2 Les premiers traitements
20Le LRMH propose donc un traitement d’urgence, par pulvérisation d’un produit fongicide à base d’ammonium quaternaire, connu pour ses propriétés fongicides et utilisé depuis de nombreuses années dans le domaine patrimonial. Ce traitement chimique est associé à une élimination physique des mycéliums (Orial, Mertz 2006a).
21Ce premier traitement se révèle malheureusement inopérant : l’apparition des mycéliums sur les surfaces très accidentées et difficilement accessibles de la cavité est en effet plus rapide que la mise en œuvre matérielle du traitement. Il fallait très vite trouver une solution de substitution. Après en avoir évalué les risques potentiels, le LRMH propose d’appliquer de la chaux vive sur les sols afin de bloquer la progression des moisissures. Plusieurs raisons ont motivé ce choix :
– les qualités désinfectantes de la chaux vive, qualités reconnues de tout temps, liées à l’augmentation du pH du substrat et à l’absorption de l’eau de constitution des microorganismes au cours du phénomène d’extinction de la chaux ;
– la bonne adéquation chimique et minéralogique avec les substrats du karst ;
– la possibilité de réaliser un traitement de masse général et rapide pour stopper l’extension incontrôlée des mycéliums.
22Cette application est faite à la fin du mois d’octobre 2001, et un contrôle de l’hydratation et de la carbonatation de la chaux est effectué (Orial, Mertz 2006a). La contamination des sols est ainsi contenue grâce à l’action conjuguée de la déshydratation des microorganismes et de l’élévation brutale du pH lors de l’extinction de la chaux. Celle‑ci provoque l’assèchement macroscopique des filaments mycéliens et, en corollaire, un assainissement des sols terreux en diminuant leur teneur en eau. Les moisissures sont efficacement inhibées sur les sols mais toutes les zones ne peuvent être traitées ainsi et il reste des foyers de développement actifs.
23Un fongicide efficace devait être sélectionné, non toxique pour les peintures et applicable en spray sur toutes les zones verticales ou difficiles d’accès. De nombreux produits fongicides sont alors testés en laboratoire par la méthode des antibiogrammes (fig. 116), sur milieu gélosé et en microplaques. L’efficacité d’une vingtaine de formulations est évaluée sur la souche de Fusarium, comme les ammoniums quaternaires à chaînes carbonées différentes, l’orthophénylphénol, le glutaraldéhyde, la carbendazime, les isothiazolinones et les imidazoles. Le formol, utilisé pendant de nombreuses années en traitement de prévention, est également testé sans résultat probant. Les meilleurs résultats sont obtenus avec l’ammonium quaternaire à base de chlorure d’alkyl dimethyl benzyl ammonium préconisé dès le début de la crise et composé d’une chaîne alcoyle en C12 et C14.

FIG. 116 – Exemples d’antibiogrammes.
© LRMH.
24Parallèlement, toutes les hypothèses d’autres traitements sont explorées : le gazage au bromure de méthyle ou l’inhibition par l’augmentation du taux de gaz carbonique, ou encore le recours à la lutte biologique. Le choix d’une non‑intervention est également envisagé avec l’espoir d’un retour, à terme, à l’équilibre naturel. Les avantages de chacune des solutions sont analysés mais aucune d’entre elles ne peut objectivement être retenue face aux risques trop importants inhérents à chacune. La solution du traitement chimique à l’ammonium quaternaire est, de ce fait, la seule qui soit en mesure d’être poursuivie sans risque, malgré les difficultés d’application, et cette décision est confortée par une recherche bibliographique approfondie, attestant de l’innocuité de ces produits sur les ouvres d’art (Petersen et al. 1993).
25Il est important d’insister sur la difficulté de traiter ce type de surface rocheuse accidentée, aux nombreuses anfractuosités et très humide : les solutions fongicides ne peuvent pénétrer dans un réseau poreux déjà gorgé d’humidité, toutes les zones contaminées ne sont pas accessibles. C’est ce qui a justifié la mise au point de différentes techniques d’application comme les compresses (fig. 117) ou encore un essai de traitement par l’ammonium quaternaire en pâte.

FIG. 117 – Compresses appliquées sur un plan incliné de la Salle des Taureaux
© LRMH.
26Malgré toutes ces interventions, le biotope de la cavité reste perturbé, ce qui se traduit, par exemple, par des apparitions locales de mucus bactériens liés au développement de Pseudomonas fluorescens et qui nécessiteront un traitement spécifique antibactérien (streptomycine + polymyxine) appliqué temporairement pendant quelques semaines. De même, des petites colonisations rondes dues principalement au développement d’une moisissure pigmentée, Gliomastix murorum, apparaissent ponctuellement et principalement sur les voûtes (sas 2, Abside, Salle des Taureaux : fig. 118). Ces zones reçoivent le même traitement fongicide que les parois. À ce jour, ces taches restent encore visibles mais, globalement, ne sont plus évolutives.

FIG. 118 – Aspect des colonisations noires sur la voûte de la Salle des Taureaux.
© LRMH.
27À partir de janvier 2004, et compte tenu de la régression notable de la contamination globale de la cavité, le comité scientifique décide de modifier le protocole de traitement et de substituer aux traitements chimiques des opérations de nettoyage et d’élimination mécanique, avec notamment la mise au point et l’utilisation d’un système d’injection‑ extraction sous vide pour les zones non ornées et non fragiles, l’objectif prioritaire étant l’élimination physique des filaments et par voie de conséquence des réservoirs de spores contaminantes portées par ces mycéliums. Des compresses ou des éponges sont également largement utilisées sur les substrats les plus fragiles (fig. 119, 120).

FIG. 119 – Élimination des colonisations noires à l’éponge.
© A. Moskalik‑Detalle.

FIG. 120 – Aspect des mycéliums éliminés.
© LRMH.
9.4.3 Le suivi scientifique de l’état sanitaire
28L’état sanitaire de la grotte est suivi grâce à de multiples analyses :
– observations macroscopiques régulières des états de surface ;
– près de 200 prélèvements de mycélium ou dépôts suspects, pour identification des espèces présentes ;
– plus de 60 prélèvements de terre, argiles et sédiments pour analyses microbiologiques qualitatives et quantitatives ;
– une vingtaine de campagnes de contrôle de la pollution atmosphérique de l’ensemble de la cavité (15 points contrôlés systématiquement).
9.4.3.1 Analyse des frottis de surface
29Dès le début de la crise et pendant les années suivantes, les dépôts suspects observés sur les sols, parois et parfois peintures sont régulièrement prélevés à l’aide de frottis stériles et à chaque apparition, pour identification des espèces responsables des colonisations visibles.
30En laboratoire les prélèvements de mycélium sont mis en culture sur des milieux synthétiques spécifiques aux moisissures (malt‑agar) pour leur identification morphologique. Les résultats prouvent que c’est Fusarium sp. qui est le plus fréquemment responsable des développements blancs visibles mais aussi Verticilium sp., Penicillium sp., Aspergillus sp., ainsi que Gliomastix sp., Gliocladium sp., Cladosporium sp. et Alternaria sp. pour les champignons à pigmentation noire de mélanine (fig. 121, 122).

FIG. 121 – Verticillium sp. (G x 400)
© LRMH

FIG. 122 – Gliocladium sp. (G x 400).
© LRMH.
9.4.3.2 Analyse des sédiments
31Méthodes
32L’évaluation quantitative et qualitative des microorganismes présents sur ou dans un support rocheux peut être abordée par des méthodes classiques de numération et d’identification (Roquebert, Orial 2002). Pour ce qui concerne les germes bactériens et contrairement à la bactériologie médicale qui est basée sur l’examen de souches isolées, celle des sols ou des roches repose avant tout sur l’examen d’une population hétérogène, aux fonctions physiologiques importantes qui permettent de classer les bactéries en groupes fonctionnels. À l’intérieur de ces groupes, les réactions s’organisent en séries complexes et imbriquées (oxydation, réduction, minéralisation, synthèse…) qui forment des chaînes ou cycles plus ou moins fermés. Généralement, les microorganismes sont en quantité trop importante dans un échantillon pour être quantifiés à partir du prélèvement de base. La préparation d’une suspension‑dilution du substrat à analyser dans une eau stérile est alors nécessaire et sert à ensemencer différents milieux de culture, favorisant la sélection des groupes fonctionnels. Cette culture stimulée va permettre de comptabiliser les germes viables et d’établir une sorte de statistique de viabilité des espèces avec définition du nombre le plus probable de germes présents. Les chiffres obtenus sont alors rapportés aux tables statistiques de Mac Grady qui permettent l’évaluation du nombre le plus probable de germes par gramme d’échantillon.
33L’identification des espèces bactériennes va apporter un complément utile à la numération. Cette identification repose sur la comparaison de divers caractères phénotypiques (morphologiques, biochimiques, physiologiques) des souches à étudier avec des souches de référence. L’automatisation des ces méthodes d’identification, utilisant des galeries comme le système API, a l’avantage de standardiser les caractères biochimiques recherchés et par suite d’améliorer la reproductibilité des résultats. Néanmoins, ces techniques ne sont adaptées qu’au diagnostic des germes cultivables puisque la condition initiale à l’identification est de disposer d’une culture pure de l’espèce. Sur les terres et sédiments de Lascaux, ce sont principalement la microflore totale hétérotrophe, les algues et les champignons microscopiques qui sont quantifiés et identifiés. Pour quelques échantillons, les germes entrant dans les groupes fonctionnels de l’azote, du soufre, du fer et du manganèse sont analysés.
34L’azote insoluble et l’azote total sont dosés suivant les procédures de Kjeldahl, dont est déduite la teneur en azote soluble. Les composés azotés des échantillons secs en poudre sont minéralisés à l’aide d’acide sulfurique concentré, contenant une concentration élevée de potassium – ce qui permet d’élever le point d’ébullition du mélange – et en présence de sélénium (catalyseur), pour former du sulfate d’ammonium. L’azote est ensuite libéré sous forme d’ammoniac grâce à l’ajout de soude concentrée, puis distillé dans une solution d’acide borique indicateur. Un dosage par titration permet de déterminer la quantité d’ammoniac, à l’aide d’une burette, avec de l’acide sulfurique qui colore en rose le tampon borique vert, en excès (dosage en retour). Les résultats sont exprimés en milligrammes d’azote par gramme de matière sèche. Pour chaque échantillon trois répétitions sont effectuées. Malheureusement, la quantité de matière prélevée à Lascaux n’a pas permis la réalisation des trois répétitions.
35La détermination de la teneur du carbone organique (COT) est faite par calcul de la différence entre le carbone total et le carbone minéral. Les analyses sont réalisées avec un analyseur (COTmètre Shimadzu) à partir de poudre sèche qui est carbonisée à 200 °C. L’appareil donne directement la masse de carbone organique total exprimée en pourcentage de la masse sèche de l’échantillon. Pour chaque échantillon trois répétitions sont effectuées.
36Résultats
37Pour l’ensemble des soixante prélèvements de terre et sédiments, prélevés tout au long de la cavité dès le début de la crise et pendant les années suivantes, la microflore totale se situe dans une fourchette, tout à fait normale pour des sols, de 104 à 108 UFC/gramme de matière. Le cortège bactérien est peu diversifié. Les espèces les plus fréquemment rencontrées sont : Pseudomonas fluorescens, Agrobacterium radiobacter, Stenotrophomonas maltophilia, Ochrobacter anthropi, Brevibacillus brevis, espèces telluriques communes dans tous les sols. Les spores de moisissures sont présentes dans des quantités moyennes entre 0 et 106 UFC/gramme de sol avec peu de diversification dans les genres : Fusarium sp., Penicillium sp., Aspergillus sp., Cladosporium sp., Gliomastix sp. et Trichoderma sp. Les algues n’ont été isolées dans aucun prélèvement.
38La fig. 123 donne l’exemple de la numération en UFC/gramme de terre sur milieu solide de la microflore totale (bactéries, champignons) et des algues de trois échantillons. Deux milieux solides (extrait de terre et Czapeck‑Dox) sont utilisés pour la numération de la microflore totale et deux autres milieux (gélose nutritive et malt‑agar) ont respectivement permis de dénombrer les bactéries et les champignons. Certains germes intervenant dans les groupes fonctionnels de l’azote et du soufre ont été quantifiés. Par exemple, ceux entrant dans l’ammonification et l’oxydation de l’azote (nitritation et nitratation) peuvent atteindre des valeurs maximales de 108 germes/gramme de sédiment (histogramme des résultats de quelques analyses). Ces germes participent à l’enrichissement d’un sol en composés azotés et correspondent au phénomène de minéralisation. En revanche, les dénitrifiants vont réduire ces composés en azote. Il s’avère que ces derniers sont dans la même fourchette de valeurs que les minéralisants. Il n’y aurait donc ni enrichissement ni appauvrissement du sol en azote. D’ailleurs, le dosage de l’azote organique total indique des valeurs autour de 0,1‑0,2 g/l et la mesure du rapport C/N donne des valeurs faibles, ne dépassant pas 17. Pour ce qui concerne les différents processus de transformation de l’élément soufre, l’évaluation des minéralisants est négative, et les oxydants du soufre (thiobacillus) ne dépassent pas 104 germes/gramme de sédiment ; les germes participant à l’oxydation du fer ou du manganèse sont absents. La fig. 124 donne l’exemple de l’analyse de la microflore entrant dans les groupes fonctionnels de l’azote, du soufre, du manganèse et du fer, pour les trois échantillons précédents.

FIG. 123 – Numération des bactéries, champignons et algues.
© LRMH.

FIG. 124 – Numération des germes entrant dans les groupes fonctionnels de N, S, Fe et Mn.
© LRMH.
39La détermination du spectre microbien des sédiments permet de conclure que le sol de la grotte présente une flore tellurique faible à normale et le rapport carbone/azote montre que ce sol est pauvre.
9.4.3.3 Contrôle de la biocontamination de l’air
40Depuis 2001, le nombre de points contrôlés le long de la cavité est passé de 7 à 15 pour une meilleure appréciation du niveau de pollution de l’air. La situation exacte des points de prélèvement est indiquée sur la fig. 125.

FIG. 125 – Plan de la cavité avec localisation des points de contrôle de contamination de l’air : en rouge, les points contrôlés pendant trente ans, en bleu ceux rajoutés au moment de la crise, en 2001.
© N. Aujoulat / ministère de la Culture et de la Communication, CNP.
41Afin de mieux visualiser l’évolution de la pollution atmosphérique, une échelle de niveau de contamination a été établie sur la base de l’ensemble des résultats des contrôles de la pollution atmosphérique obtenus au cours des trente dernières années, période pendant laquelle la cavité pouvait être considérée comme saine ou tout au moins en équilibre. Cette échelle a également été définie en fonction de notre expérience acquise dans ce domaine pour les autres grottes ornées.
42Pour tenter d’avoir une image plus synthétique de l’évolution de la contamination et pouvoir ainsi dégager des tendances, les fourchettes ont été codifiées avec des couleurs qui ont ensuite été attribuées à chaque mesure. Six niveaux de contamination ont été retenus et les codifications adoptées sont les suivantes :

43Pour ce qui concerne les moisissures, l’examen de l’image des niveaux de contamination (fig. 126) montre que, majoritairement, l’air de la cavité s’est maintenu à des niveaux de contamination très faibles, voire nuls, dès février 2002 et, de façon très nette, par exemple entre janvier et juin 2003. À partir de mars 2004, on note une inflexion à la hausse du niveau de contamination de la cavité, pour atteindre des valeurs élevées à très élevées dans toute la cavité en décembre 2004. Depuis cette période, la contamination de l’air a baissé régulièrement pour atteindre actuellement un niveau faible à très faible. Toutefois, le niveau quasiment nul de mars 2003 n’est pas encore retrouvé. Les identifications des espèces montrent que globalement, jusqu’en mars 2004, les rares moisissures présentes dans l’air sont peu diversifiées. Quelques Fusarium sp., Cladosporium sp. ou Gliomastix sp. sont ponctuellement isolés. À partir de cette période, le nombre d’espèces différentes augmente de façon significative avec majoritairement Penicillium sp. et Aspergillus sp., rencontrés dans toute la cavité. Contrairement au Fusarium, ces espèces sont aériennes et apportées, pour la plupart, par les mouvements divers engendrés par l’activité humaine.

FIG. 126 – Évolution du niveau de pollution fongique de novembre 2001 à février 2009.
© LRMH.
44Pour ce qui concerne les bactéries, l’examen de l’image des niveaux de contamination (fig. 127) montre la période de juin 2002 à janvier 2003 comme étant sensiblement plus polluée qu’au début de la crise en novembre 2001. Puis, le niveau baisse au cours de l’année 2003 pour remonter en mars 2004 et atteindre des valeurs très élevées en décembre 2004 (fig. 128). Depuis, la contamination bactérienne a notablement baissé pour retrouver des valeurs faibles à moyennes. Majoritairement, les espèces isolées sont des Micrococcacceae, des Bacillus sp. ou des staphylocoques et sont liées à l’activité humaine.

FIG. 127 – Évolution de la contamination bactérienne de novembre 2001 à février 2009.
© LRMH.

FIG. 128 – Chromatogramme de l’ammonium quaternaire témoin et du même ammonium quaternaire après contact avec Stenotrophomonas maltophilia.
© LRMH.
45Ces données confirment que les contaminations fongiques observées sur les sols et parois, se traduisant par la manifestation visible des mycéliums, ne sont pas corrélées à une pollution de l’air. Au plus fort de la contamination des parois par le Fusarium solani (février 2002), l’air ne présente pas de pollution fongique.
46L’augmentation des niveaux de contamination constatée à partir de mars 2004 et pendant l’année 2005 est en relation directe avec une activité humaine importante. C’est pourquoi il faut rester très vigilant sur les attitudes comportementales et le nombre de personnes qui pénètrent dans la grotte.
47Il faut toutefois préciser que les contrôles de la pollution aérienne donnent une image à un instant précis, qui peut être très fluctuante en fonction des événements qui précèdent la mesure. De plus, la grotte est un espace fermé et les spores ne peuvent être évacuées, elles n’ont qu’une possibilité, se déposer sur les surfaces. Quand les valeurs sont contrôlées en baisse après une augmentation, cela signifie seulement que les spores ont décanté sur les parois, participant ainsi à la formation d’un biofilm, et qu’elles sont potentiellement prêtes à germer.
9.5 Les investigations complémentaires
9.5.1 Complément d’informations sur l’espèce Fusarium solani isolée dans la cavité
48Dès le début de la contamination, de nombreuses questions se posent sur Fusarium solani.
49Est‑ce que toutes les souches appartiennent à la même espèce ? Quelle est la diversité à l’intérieur de l’espèce ? Quelle est la répartition des espèces et des souches dans la grotte ? Y‑a‑t‑il eu invasion massive d’une seule souche de Fusarium, introduite par l’extérieur et qui se serait propagée dans toute la grotte à la suite des travaux de 2000 ?
50Des investigations complémentaires en biologie moléculaire sont alors menées par Joëlle Dupont, professeur au Muséum d’histoire naturelle de Paris (Dupont et al. 2007). Trente‑six colonies de Fusarium sont isolées à partir des prélèvements réalisés en cinq points de la grotte : Salle des Taureaux, Passage, Abside, Nef et Galerie du Mondmilch. L’analyse du polymorphisme génétique suggère la présence de trois espèces (Sp1, Sp2 et Sp3) du complexe Fusarium solani. Parmi les trente‑six isolats, il y a dix‑neuf souches qui se répartissent de la façon suivante : onze souches de l’espèce 1, deux souches de l’espèce 2, six souches de l’espèce 3. Les zones situées au fond de la grotte (Galerie du Mondmilch et Nef), les moins fréquentées, paraissent abriter des communautés plus homogènes que celles qui sont situées vers l’entrée. La plupart des génotypes semblent être « locaux » ; par exemple, les cinq génotypes de l’espèce 1 trouvés dans la Salle des Taureaux sont différents de ceux trouvés dans la Nef au même moment.
51La contamination est donc multiple et dispersée, et il ne s’agit pas de l’envahissement par une seule souche qui se serait propagée tout au long de la cavité. Fusarium solani a pu être introduit dans la grotte suivant plusieurs voies séparées ou combinées, (eaux de percolation provenant du sol végétal supérieur, ou apport des sols extérieurs par les visiteurs, les petits animaux ou encore les eaux de ruissellement). L’hypothèse la plus plausible est que les espèces de Fusarium, dominantes dans toute la cavité, ont bénéficié, à un moment précis, de conditions microenvironnementales propices à leur germination, plus particulièrement au moment des travaux de réfection des centrales de traitement d’air. Les changements microclimatiques ont induit la germination simultanée des différentes souches de Fusarium.
9.5.2 Étude de la biodégradabilité de l’ammonium quaternaire par les germes telluriques spécifiques de la grotte
52L’utilisation de sels d’ammonium quaternaire pour les traitements biocides a suscité, au sein du comité, un certain nombre de questions concernant notamment une éventuelle biodégradabilité par les germes telluriques de la cavité. Des expérimentations ont donc été mises en œuvre en laboratoire, pour vérifier ou infirmer cette hypothèse. Il faut rappeler que, dans la littérature, nombreuses sont les publications abordant les effets des ammoniums quaternaires sur les microorganismes, et plusieurs auteurs ont ainsi pu attribuer l’activité antimicrobienne de ces sels à divers mécanismes :
– la dénaturation plus ou moins sélective des protéines ou des enzymes, par solubilisation et dépolymérisation, entraînant l’inactivation des enzymes intervenant dans la respiration et la glycolyse et l’inactivation de la déshydrogénase ;
– la fixation au niveau des ribosomes, avec arrêt de la synthèse protéique ;
– la lyse de la membrane cellulaire, avec perturbation des échanges osmotiques. L’activité bactéricide des composés alkyl ammonium et particulièrement du chlorure de benzyl alkyl ammonium (C12‑C18), a été suggérée pour la première fois par Domagk en 1935.
53Nos expérimentations ont été réalisées sur quatre microorganismes isolés des sols argileux de la grotte de Lascaux, mais seuls les résultats obtenus avec deux types de bactéries, Stenotrophomonas maltophilia et Bacillus sp. sont présentés ici. Trois types d’investigations ont été menés :
– la mise en culture sur un milieu minimum dans lequel les seules sources de carbone et d’azote, indispensables au développement des microorganismes, sont fournis par l’ammonium quaternaire ;
– l’analyse en chromatographie en phase liquide (HPLC) du biocide après contact avec les microorganismes pour évaluer la capacité de ceux‑ci à dégrader le produit ;
– enfin l’examen, en microscopie électronique à transmission (MET), de l’impact de l’ammonium quaternaire sur les microorganismes grâce à la visualisation de leur morphologie.
54Pour les besoins analytiques, les bactéries ont été mises en contact avec le produit biocide, dans un milieu liquide. Puis, après filtration, les bactéries ont été utilisées pour la mise en culture et les observations au MET, et la solution filtrée a été récupérée pour les analyses en HPLC.
9.5.2.1 Mise en culture sur milieu minimum liquide et solide
55En milieu liquide, l’éventuelle dégradation d’un produit biocide peut être vérifiée par la mise en évidence de la croissance ou de la survie des microorganismes. Les résultats montrent que les microorganismes sont incapables de se développer sur un tel milieu. Par ailleurs, quand ces microorganismes ayant été en contact avec le biocide sont réensemencés sur des milieux dépourvus de produit toxique, ils ne se développent pas. En milieu solide, la dégradation du produit biocide est mise en évidence par l’apparition d’un halo translucide autour de la colonie, indiquant la dégradation du produit. Aucun phénomène de cette nature n’a été constaté. Les résultats montrent que les microorganismes sont incapables de se développer sur un milieu solide minimum additionné d’ammoniums quaternaires.
9.5.2.2 Analyse en HPLC
56Ces analyses ont été réalisées en collaboration avec Witold Novik, biochimiste au LRMH. Le chromatogramme obtenu met en évidence la disparition de certaines chaînes du produit après contact avec les microorganismes. Cependant, aucun produit néoformé ou issu d’une éventuelle dégradation partielle n’est détecté (fig. 128).
57On peut constater que pour le spectre de l’ammonium quaternaire en contact avec une préculture de Stenotrophomonas maltophilia, deux pics correspondant à deux chaînes longues, le C14 et le C16, disparaissent complètement, et que le pic dominant de la chaîne C12 diminue très fortement.
58L’hypothèse peut donc être émise que les chaînes grasses du produit qui ont disparu sont complètement dégradées. Aucun autre produit pouvant être issu de la dégradation du biocide n’est détecté.
9.5.2.3 Examen en microscopie électronique à transmission
59Pour comprendre le phénomène de disparition des chaînes, le dosage d’azote dans les parois et à l’intérieur des cellules (cytoplasme) des différents microorganismes a été effectué grâce à la microscopie électronique en transmission, couplée à la spectroscopie de perte d’énergie d’électrons transmis. Les examens ont été réalisés en collaboration avec le docteur Jaâfar Ghanbaja, du service commun de Microscopies électroniques et microanalyses X de la faculté des sciences Henri‑Poincare de Nancy.
60Les observations des coupes ultra‑minces permettent une comparaison de la morphologie des différents microorganismes avant et après contact avec le biocide. On peut constater que les cellules qui ont été en contact avec le produit ont subi des modifications significatives de leurs parois et membranes, de leur matériel génétique et de leur taille, par rapport au microorganismes témoins (fig. 129‑132). Salton, en 1951, suggère que les ammoniums quaternaires provoquent la mort des cellules par interaction avec les membranes cytoplasmiques. Ultérieurement, en 1984, Isomaa essaie d’expliquer le mécanisme d’action des surfactants (C10‑C20) et propose que la cible sur laquelle les surfactants agissent est la bicouche phospholipidique des cellules. Les figures montrent clairement que les membranes des bactéries sont dégradées et que les cellules sont vidées de leur contenu, ce qui explique la réduction de leur taille.

FIG. 129 – Stenotrophomonas maltophilia (G x 20 000).
© LRMH.

FIG. 130 – Stenotrophomonas maltophilia après contact avec le Vitalub QC 50 (G x 20 000).
© LRMH.

FIG. 131 – Bacillus sp. témoin (G x 20 000).
© LRMH.

FIG. 132 – Bacillus sp. après contact avec le Vitalub QC 50 (G x 20 000).
© LRMH.
61Le calcul des rapports N/C du cytoplasme et des structures membranaires des bactéries en contact avec l’ammonium quaternaire montre une légère augmentation du taux d’azote (2 %). Cette faible augmentation peut être attribuée à la faible concentration en ammonium quaternaire utilisée, de l’ordre de 0,5 ppm de matière active ; elle est localisée essentiellement au niveau cytoplasmique.
62Cette étude montre que les ammoniums quaternaires utilisés sont non biodégradables par les microorganismes de la grotte de Lascaux. La disparition de certaines chaînes, mise en évidence par la technique HPLC, du biocide est expliquée par l’adsorption préférentielle de ces chaînes sur les membranes et parois des microorganismes. L’adsorption des molécules de biocide sur les structures membranaires des microorganismes entraîne une diminution de la concentration minimale inhibitrice dans le milieu et baisse ainsi leur pouvoir biocide.
63L’étude réalisée au niveau cellulaire par Obeidou en 1992 a montré que les sels d’ammonium quaternaire agissent sur les enzymes du métabolisme primaire de l’azote. Par ailleurs, Nagal et al (1996) ont travaillé sur sept souches de Pseudomonas fluorescens, une souche de Pseudomonas aeruginosa et une souche d’Escherichia coli. Les auteurs ont conclu que les souches testées sont incapables de décomposer l’ammonium quaternaire. Aucune croissance de bactéries n’a été constatée sur un milieu minimum additionné d’ammonium quaternaire comme seule source de carbone et/ou d’azote.
64Les résultats obtenus spécifiquement avec les germes de la grotte de Lascaux concordent donc avec ceux déjà publiés dans la littérature.
9.6 La contamination de 2007
65En juillet 2007, de nouvelles colonisations noires apparaissent sur les voûtes et parois du passage et de la nef ainsi que sur les champs ornés de l’abside. Des prélèvements sont réalisés par frottis, et les résultats des analyses montrent qu’il s’agit d’espèces modérément hydrophiles (aw < 0,9) d’Ulocladium sp. et de Gliocladium sp. (fig. 133, 134).

FIG. 133 – Colonisations noires sur la voûte de l’Abside.
© LRMH.

FIG. 134 –Ulocladium sp. (G x 400).
© LRMH.
9.6.1 Le premier traitement
66Compte tenu de l’impact tant mécanique que chimique des moisissures sur les peintures et sur les gravures, il paraît à nouveau impératif de procéder rapidement au traitement biocide de toutes les zones contaminées et à l’élimination des résidus mycéliens. Le but d’un traitement biocide n’est pas de créer un vide biologique mais d’éliminer la masse organique visible, signe du déséquilibre. Ce traitement doit impérativement comporter une application chimique, destinée à éradiquer les moisissures, suivie d’une élimination mécanique ayant pour but de débarrasser le support de tous les résidus organiques. L’objectif du traitement chimique proprement dit est donc de diminuer le réservoir de contaminants et de stopper la progression et l’extension des champignons. Il est également décidé par le comité une mise au repos de la cavité pendant une période minimale de trois mois.
67De nouveaux antibiogrammes sont alors programmés. Six solutions biocides, toutes à base d’ammonium quaternaire, sont testées pour déterminer leur efficacité sur les moisissures isolées. Leur composition est la suivante :
– solution A : chlorure d’alkyl dimethyl benzyl ammonium 50 % ;
– solution B : chlorure d’alkyl dimethyl benzyl ammonium 25 % 2‑octyl‑2H‑isothiazole‑3‑one 2,8 %, 2‑2‑oxydiethanol 25 à 50 % ;
– solution C : chlorure de benzododecinium < 2,5% ;
– solution D : chlorure de benzododecinium 10 % à 25 %, chlorure de miristalkonium 10 % à 25 %, 2 octyl‑2H‑isothiazole‑3‑one < 2,5 % ;
– solution E : formides N, octylisothialozinone 5 %.
68Les résultats des antibiogrammes montrent que les solutions B, C et D sont les plus performantes. Toutefois, la mesure du pH des solutions indique une acidité trop élevée dans le cas de la solution B, ce qui pourrait représenter un danger pour le support calcaire. Les deux autres produits sélectionnés ont un pH proche de la neutralité et peuvent donc être utilisés sans risque. Notre choix se porte sur la solution D en raison de la présence d’isothiazolinone, principe fongicide qui renforce l’action biocide de l’ammonium quaternaire. Le traitement est réalisé par brumisation (fine pulvérisation sous forme de brouillard) de la solution D, localement, sur les surfaces contaminées pendant trois jours consécutifs à raison d’une application par jour.
69Pour déterminer l’efficacité in situ du traitement, un protocole de suivi est mis en place, comportant différents niveaux de contrôle :
1 – contrôle de la contamination atmosphérique ;
2 – observation des états de surface et relevés photographiques ;
3 – mesures de l’activité métabolique globale par l’adénosine triphosphate (ATP) qui est le marqueur de viabilité des organismes (Lundin et al. 1986) ; le dosage d’ATP est basé sur l’évaluation de la quantité de lumière émise ; l’intensité lumineuse émise est proportionnelle à la concentration d’ATP ; l’émission de lumière, mesurée à l’aide d’un luminomètre, est exprimée en RLU (relative light unity) ;
4 – identification des espèces fongiques ;
5 – évaluation de la viabilité des microorganismes par des observations microscopiques en épifluorescence ; cette technique est basée sur l’utilisation d’un colorant fluorescent qui met en évidence les microorganismes viables (Jones, Senft 1985).
70L’ensemble de ces mesures est effectuée avant, pendant et après le traitement et doit permettre de suivre l’évolution des effets et de l’efficacité du traitement. Onze zones sont choisies pour faire l’objet des contrôles de surface.
71Dans le Passage :
1 – colonisation noire sur la paroi gauche au milieu du Passage (fig. 135) ;
2 – colonisation noire sur la paroi droite en face de la zone 1 ;
3 – duvet blanc sur la voûte au milieu du Passage ;
4 – colonisation noire sur la paroi gauche à la fin du Passage ;
5 – zone sans duvet ni colonisation visible, paroi gauche au milieu du Passage. Dans l’Abside :
6 – colonisation noire sur la paroi gauche au niveau de la margelle du Puits ;
7 – colonisation noire sur la paroi droite au niveau de la margelle du Puits (fig. 136) ;
8 – colonisation noire au fond de l’Abside à côté de la trappe du Puits du Sorcier. Dans la Nef :
9 – colonisation noire à côté du panneau de l’Empreinte ;
7210 – colonisation noire sur la voûte à l’entrée de la Nef ;
11 – zone sans duvet ni colonisation visible sur la paroi, côté gauche à l’entrée de la Nef.

FIG. 135 – Aspect des colonisations noires de la zone 1.
© LRMH.

FIG. 136 – Aspect des colonisations de la zone 7.
© LRMH.
73Après traitement chimique des surfaces et mise au repos de la cavité, le niveau de pollution atmosphérique est majoritairement faible. Sur la plupart des points de contrôle, le taux de moisissures ne dépasse pas 67 UFC/m3 d’air et celui des bactéries 84 UFC/m3 d’air. Aucune espèce nouvelle n’est identifiée dans l’air et on retrouve quelques spores de Verticillium sp., Ulocladium sp. et Aspergillus sp. Sur la majorité des points de contrôle, le résultat des mesures de l’activité métabolique globale avant et après trois mois de repos montre une diminution à l’exception de deux points : la zone test 6 et la zone test 10.
74Pour la zone test 10, on note une augmentation de l’ordre de 17 % ; par contre, sur la zone 6, une augmentation de l’ordre de 50 % est enregistrée. Cette augmentation peut être expliquée soit par la difficulté d’accéder et de traiter toutes les zones d’une façon homogène (zone 10), soit par la présence de cavernicoles : l’ATP de ces organismes interfère avec celle des microorganismes (zone 6). De même, l’écart type important entre les résultats des prélèvements sur cette zone dénote de la grande disparité des valeurs, liée elle aussi à la présence ou non d’insectes sur la surface prélevée (fig. 137).

FIG. 137 – Comparaison de l’activité métabolique, avant traitement, en décembre 2007 et après trois mois de repos, en mars 2008.
© LRMH.
75Les observations en épifluorescence avant et trois mois après le traitement montrent également une nette diminution des cellules fongiques viables (peu ou plus de fluorescence) pour la majorité des prélèvements par scotch (fig. 138a‑b). Sur la zone test 6, certains éléments fluorescents observés après traitement correspondent aux débris des cavernicoles encore viables au moment du prélèvement (fig. 138c).

FIG. 138 – a zone 1, cellules fongiques fluorescentes observées sur la paroi gauche au milieu du Passage en décembre 2007 ; b trois mois après le traitement, aucune fluorescence n’est observée ; c zone 6, débris de cavernicoles mis en évidence par épifluorescence sur la paroi gauche au niveau de la margelle du Puits, trois mois après traitement.
© LRMH.
76Enfin la comparaison des espèces cultivées indique qu’il n’y a pas eu de changement au niveau des genres entre décembre 2007 et mars 2008. Pour certaines zones, aucun champignon ne s’est développé sur les milieux de culture. Globalement, des spores viables sont toujours présentes malgré une baisse de l’activité métabolique globale. Les résultats du suivi du traitement montrent qu’il y a concordance entre les mesures d’ATP, les observations en épifluorescence et les cultures à partir des frottis. La pollution atmosphérique a notablement baissé après la mise au repos de la cavité et, majoritairement, le niveau de pollution est faible.
77Le traitement a eu une action positive mais non radicale pour la plupart des zones. Dans les zones les plus contaminées (Passage) et/ou les plus difficiles d’accès (voûte de la Nef), cette action est cependant insuffisante. Le traitement biocide a bien joué un rôle de stabilisation de la contamination fongique visible, mais cette stabilité reste fragile et une campagne complémentaire de traitement est proposée afin de réduire davantage les réservoirs de contaminants. L’élimination des recouvrements de mycéliums semble indispensable sur toutes les zones contaminées non ornées et celles, ornées, qui peuvent le supporter. Par ailleurs et en raison de l’inaccessibilité de certaines zones – comme la voûte de la Nef –, une pulvérisation de solution biocide est souhaitable, l’élimination mécanique étant impossible à ce jour.
9.6.2 L’étude d’impact
78En avril 2008, un débat s’instaure au sein du comité scientifique sur l’opportunité de poursuivre les traitements préconisés. Il est donc décidé de mettre en place une étude d’impact complémentaire des traitements potentiels (chimique et nettoyage) sur les supports. Un protocole est mis au point avec des critères de sélection de zones test et d’évaluation des traitements de nettoyage et de désinfection. Quatre zones – désignées par les lettres A, B, C, D – sont sélectionnées dans le Passage en fonction du faciès d’altération des parois et du niveau de la contamination microbiologique (fig. 139). À chacune des zones correspond un traitement particulier (fig. 140‑143). Les nettoyages et les applications des biocides sont mis en œuvre par l’équipe de restaurateurs :
– nettoyage au pinceau avec récupération des résidus ;
– application locale d’une solution à base d’ammonium quaternaire et d’isothiazolinone, complétée sur une petite surface test par une application complémentaire d’isothiazolinone seul.

FIG. 139 – Localisation des quatre zones choisies dans le Passage.
Fond graphique : © N. Aujoulat / ministère de la Culture et de la Communication, CNP.

FIG. 140 – Zone A, zone fragile avec une intense colonisation : nettoyage léger et traitement biocide.
© LRMH.

FIG. 142 – Zone C, zone avec intenses colonisations noires : nettoyage profond et traitement biocide.
© LRMH.

FIG. 141 – Zone B, zone fragile avec colonisations noires : nettoyage léger sans traitement biocide.
© LRMH.

FIG. 143 – Zone D, zone avec légères colonisations noires : nettoyage léger sans traitement biocide.
© LRMH.
79Le protocole d’évaluation des niveaux d’infection et de l’activité métabolique des microorganismes actifs, avant et après traitement, est obtenu grâce à plusieurs techniques, soit par le biais de prélèvements soit par examen direct :
– prélèvement par frottis de surface pour l’étude taxonomique après mise en culture, en laboratoire, sur milieux adaptés ;
– prélèvement par frottis de surface pour la détermination de l’activité métabolique par la mesure de l’ATP ;
– examen microscopique des surfaces contaminées à l’aide d’un microscope portable ;
– analyse des pigments biogéniques par spectroscopie en réémission.
9.6.2.1 Mise en culture des frottis
80L’étude taxonomique à partir des frottis réalisés sur chacune des zones révèle la présence majoritaire d’Ulocladium sp. et de Curvularia sp. accompagnés parfois de Verticillium sp. et de Penicillium sp. Les mises en culture montrent qu’aucune colonie ne se développe à partir des prélèvements sur les zones A et C qui ont été traitées avec la solution biocide (fig. 144).

FIG. 144 – Tableau récapitulatif des mises en culture avant et après intervention.
9.6.2.2 Mise en culture des résidus de nettoyage
81Les résidus récupérés pendant l’opération de nettoyage sont analysés pour mise en évidence de leur niveau de contamination. L’examen microscopique permet de constater l’imbrication importante des filaments mycéliens autour des particules minérales (fig. 145). 100 μl d’une suspension préparée à partir de ces résidus sont inoculés sur trois milieux synthétiques spécifiques à la culture des moisissures, le DRBC (rose bengale agar), le CzD (Czapeck‑Dox) et le DG18 (milieu au glycérol pour espèces xérophiles). Après 24 jours d’incubation à 24 °C, les espèces sont identifiées suivant leurs critères morphologiques ainsi que par le biais de la biologie moléculaire (fig. 146). Majoritairement les isolats appartiennent à des espèces modérément hydrophiles comme Ulocladium sp., Curvularia sp., Cladosporium sp. et Ochroconis sp.

FIG. 145 – Aspect des filaments mycéliens entourant les particules minérales.
© LRMH.

9.6.2.3 Test complémentaire sur l’efficacité des biocides
82Par diffusion dans les milieux de culture synthétiques
83Trois milieux de culture différents (DBRC, CzD et malt agar) sont inoculés avec la solution à base de résidus précédemment utilisée. Cette action est renouvelée cinq fois pour la répétabilité des résultats. Un jour plus tard, un trou de 1 cm de diamètre est creusé au centre du milieu de culture ensemencé et cet espace est rempli avec divers biocides :
– mélange à 5 % d’ammonium quaternaire et d’isothiazolinone (Dévor Mousse),
– solution à 3 % d’isothiazolinone (Parmétol DF12) [fig. 147],
– solution prête à l’emploi d’un mélange d’isothiazolinone et d’ammonium quaternaire (Keim Algizid Plus),
– mélange Dévor Mousse + Parmétol DF12,
– mélange Dévor Mousse + Keim Algizid Plus.

FIG. 147 – Mise en évidence de l’action fongicide du Parmétol DF12 après 16 semaines.
© LRMH.
84Les observations macroscopiques des différents milieux montrent que le Parmétol DF12 améliore l’efficacité du traitement biocide. Toutefois, le mélange avec les ammoniums quaternaires peut être conseillé pour faciliter la pénétration du fongicide – comme l’isothiazolinone – à l’intérieur du biofilm fongique et diminuer l’éventuel impact allergique d’un traitement à l’isothiazolinone seul.
85Sur les argiles
86L’efficacité des formulations biocides est également testée directement sur les sédiments argileux provenant de Lascaux. Après avoir mélangé ces argiles à de l’eau, la pâte obtenue est déposée dans des boîtes en plastique. Après solidification, ces supports sont inoculés avec les souches provenant directement de la grotte. Les éprouvettes ainsi préparées sont mises en incubation sur lit de vermiculite, dans des enceintes simulant la haute humidité présente dans la cavité. Après deux semaines, les surfaces d’argiles contaminées sont traitées avec les différents produits biocides dont le peroxyde d’hydrogène (H2O2). Alors que le traitement avec H2O2 fait visiblement gonfler immédiatement le matériau argileux, l’application de la formulation fongicide ammonium quaternaire + isothiazolinone donne les meilleurs résultats pour le contrôle de la recontamination du sol argileux.
9.6.2.4 Test de minéralisation du Dévor Mousse
87Ce test est effectué avec des Biolog MT microtiterplates. Il consiste à ensemencer des micropuits (en l’occurrence quatre‑vingt‑seize) préparés avec un indicateur redox qui change de couleur en fonction de l’activité microbienne. Une série de puits est remplie avec une solution de glucose à des concentrations décroissantes selon un facteur de 10, à partir de 10 % (10 %, 1 %, 0,1 %, etc.). L’autre série est remplie, dans les mêmes conditions, avec une solution de Dévor Mousse. Les puits sont ensuite ensemencés avec un mélange de microorganismes issus des échantillons des sédiments argileux de la grotte. Les résultats montrent clairement que l’activité microbienne est stimulée avec les concentrations élevées en glucose. Avec le Dévor Mousse, l’activité microbienne est inhibée à partir d’une concentration inférieure à 0,1 % et augmente très légèrement à 0,01 % (fig. 148).

FIG. 148 – Biolog MT plates avec des concentrations décroissantes de glucose (gauche) et de Dévor Mousse (droite).
© LRMH.
88Les résultats de ces tests avec les MT plates, largement connues comme outils de mise en évidence de la biodégradation des composés organiques, permettent de conclure à une non‑dégradation du Dévor Mousse par les microorganismes de la cavité.
9.6.2.5 Mesure de l’activité métabolique
89Ces mesures faites avant traitement, après un premier test de nettoyage, après le nettoyage effectif puis enfin après les traitements biocides indiquent une baisse notable de l’activité métabolique après le traitement avec la solution biocide et une absence d’activité sur les zones traitées en complément avec l’isothiazolinone seul (Parmétol DF12) [fig. 149].

FIG. 149 – Comparaison des résultats des mesures ATP des quatre zones.
© LRMH.
9.6.2.6 Résultats
90Les derniers résultats de l’étude d’impact microbiologique montrent que le traitement par un mélange d’ammonium quaternaire et d’isothiazolinone suivi d’une application d’isothiazolinone seul donnent de très bons résultats. Cinq mois après le traitement, il n’y a pas de reprise de colonisation visible sur ces zones. Cependant, l’étude d’impact des nettoyages montre que dans la partie droite il est très difficile d’intervenir sur les supports, très fragiles et sur lesquels les gravures sont nombreuses.
9.7 Conclusions
91Aujourd’hui, même si la contamination n’est plus comparable, en intensité, avec celle du début de la crise en septembre 2001, elle n’est toujours pas éradiquée. Tout porte à croire que l’équilibre de la grotte est précaire, et pour le retrouver il faut connaître précisément les paramètres environnementaux qui initient les développements afin de les contenir.
92Dans toute opération de traitement, le résultat final est influencé par quatre facteurs interdépendants, regroupés dans le cercle factoriel, dit « cercle de Sinner ». Si on adapte ce cercle à la problématique de gestion d’une crise biologique, ces facteurs sont les suivants (fig. 150) :
– la gestion du climat,
– les nettoyages,
– les traitements biocides,
– une action répétée.

FIG. 150 – Comparaison des résultats des mesures ATP des quatre zones.
© LRMH.
93Or, dans une stratégie globale d’intervention, si l’un des facteurs est diminué, on doit obligatoirement compenser cette perte en augmentant un ou plusieurs des autres facteurs si l’on veut maintenir la qualité finale du résultat. Dans le cas de la partie droite de la grotte, un débat doit s’instaurer sur les équilibres à trouver entre les différentes actions. Les avancées progressives des connaissances de l’environnement chimique, climatique et microbiologique devraient à terme permettre de définir la meilleure stratégie de conservation des oeuvres, dans le respect de ce milieu particulièrement complexe.
94Bibliographie
95Brunet, Vouvé 1996 : BRUNET (J.), VOUVÉ (J.). — La conservation des grottes ornées. Paris : CNRS, 1996, 263 p.
96Dupont et al. 2007 : DUPONT (J.), JACQUET (C.), DENNETIERE (B.), LACOSTE (S.), BOUSTA (F.), ORIAL (G.), CRUAUD (C.), COULOUX (A.), ROQUEBERT (M.‑F.). — Invasion of the French Paleolithic painted cave of Lascaux by members of the Fusarium solani species complex. Mycologia, 99, 4, 2007, p. 526‑533.
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