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Saison d’une peste (avril - septembre 1590)

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Bruno Bizot
, 
Dominique Castex
, 
Patrick Reynaud
, 
et al.

3. Validation de la saisonnalité des décès et authenticité biologique de la nature de l'épidémie

Gérard Aboudharam, Michel Drancourt, Olivier Dutour, Hélène Martin, Didier Raoult et Michel Signoli

Texte intégral

Détermination de la saison du décès à partir des dents

1En histologie dentaire, des techniques ont été mises en œuvre afin de déterminer l’âge au décès des individus (Gustafson, 1950 ; Dechaume et al., 1960 ; Bang et Ramm, 1970 ; Johanson, 1971 ; Burns et Maples, 1976 ; Maples, 1978 ; Stott, 1982 ; Bromage et Dean, 1985 ; Lovejoy et al., 1985a et b ; Naylor et al., 1985 ; Charles et al., 1986 ; Kilian et Vlcek, 1989). Parmi elles, nous nous sommes intéressés plus particulièrement à l’analyse des anneaux de cément dentaire. Nous avons utilisé cette méthode, non pas afin de connaître l’âge des sujets, mais afin de préciser la saison au cours de laquelle ils sont décédés. Cette méthode d’étude a déjà été appliquée avec succès sur des séries animales actuelles et fossiles (Martin, 1994 et 1995).

2Le cément est un tissu minéralisé situé à la surface de la racine des dents. Il recouvre la dentine radiculaire. La première fonction du cément est de bien fixer la racine dentaire au périodonte. C’est l’ensemble os alvéolaire-ligament-cément qui assure l’insertion fonctionnelle des dents dans les alvéoles osseuses. Des cellules spécialisées, les cémentoblastes, sont responsables de la cémentogenèse. Elles synthétisent et sécrètent les précurseurs de la matrice organique du cément. Le matériel extracellulaire ou tissu cémentoïde va se minéraliser pour former le cément. L’apposition cémentaire va progresser d’une part en épaisseur, d’autre part en direction apicale. Le cément est composé d’une trame organique, d’une phase minérale et d’eau. La trame organique est essentiellement composée de collagène. La phase minérale est essentiellement constituée de sels de phosphate de calcium sous forme de cristaux d’hydroxyapatite.

3Le cément s’appose de manière cyclique aussi longtemps que la dent est présente sur l’arcade dentaire, et ce, indépendamment de la vitalité pulpaire, de telle sorte que l’épaisseur du cément augmente au cours du vieillissement.

4La méthode d’analyse repose sur l’observation de l’apposition cyclique du cément radiculaire. Observé en lumière polarisée transmise, le dépôt cémentaire va se traduire par des bandes alternées de différentes densités :

    • 239 La terminologie utilisée ici est celle définie au colloque de Bondy, en 1992, par J. Castanet, F. M (...)

    une bande large et translucide, ou zone239, va se former en période d’accroissement de la cémentogenèse (soit au cours de la bonne saison) ;

  • une bande sombre et étroite ou annulus va se former durant une période correspondant à un ralentissement de ce phénomène (c’est-à-dire au cours de la mauvaise saison).

5L’observation de nombreuses dents de mammifères actuels a montré que la formation des dépôts est fonction de rythmes biologiques intrinsèques, influencés secondairement par les autres rythmes de l’environnement (Grue et Jensen, 1979 ; Charles et al., 1986 ; Castanet, 1980). Ainsi cette méthode, testée sur des restes dentaires d’animaux sauvages (parfois affouragés), vivant entre 40° et 60° de latitude Nord, a montré que la période d’accroissement du cément dentaire se situait entre fin avril/début mai et fin décembre/début janvier.

6En fait, on peut même définir : le début de la bonne saison (printemps), approximativement de fin avril/début mai à mi-juin ; la période estivale ou bonne saison (été), approximativement de mi-juin à fin octobre/début novembre ; la fin de la période estivale ou fin de bonne saison (automne), approximativement de fin octobre/mi-novembre à fin décembre/début janvier.

7Chez les humains, les observations réalisées par les biologistes ont montré que la formation du cément dentaire répondait également à un rythme cyclique annuel dans la quasi-totalité des cas (Charles et al., 1986). Les travaux actuels (Charles et al., 1986) ont porté essentiellement sur l’étude de l’âge au décès des individus. En ce qui concerne la fiabilité de cette méthode, elle a de ce point de vue, fait ses preuves. Condom et ses collaborateurs (Charles et al., 1986, p. 326) signalent : « La méthode d’estimation de l’âge par l’analyse des anneaux de cément semble être la méthode la plus fiable dont on dispose en ce qui concerne les adultes, comparée du point de vue de l’exactitude aux meilleures techniques multivariées d’estimation d’âge. » Ajoutons pour notre part que, si sa fiabilité a fait ses preuves dans l’estimation de l’âge des individus, ce pourrait aussi être le cas pour l’estimation de la saison, l’étude relevant du même principe. Par ailleurs, les premiers résultats obtenus vont tout à fait dans ce sens (Crubézy et al., 1996a et 1996b).

  • 240 Le cément s’est révélé souvent altéré en surface, voire arraché par plaques. L’observation des dépô (...)

8Dans le cadre de ce travail, nous avons étudié 27 dents qui ont toutes été prélevées dans l’os maxillaire ou mandibulaire240. L’observation nécessite l’utilisation d’un microscope à lumière polarisée transmise. À l’état sec, le cément est composé essentiellement de cristaux d’hydroxyapatite. Les dépôts de cément estivaux sont constitués d’une multitude de cristaux apparemment orientés de manière différente car ils paraissent, en lumière polarisée parallèle, toujours éclairés quelle que soit la position de la platine. En revanche, les dépôts hivernaux restent toujours éteints. Étant donné que les sections hexagonales de l’hydroxyapatite, c’est-à-dire les sections perpendiculaires à l’axe d’allongement du cristal sont toujours éteintes, il semble que la distinction, sous lumière polarisée des dépôts estivaux et des dépôts hivernaux, résulte d’une orientation différente des cristaux d’hydroxyapatite. Différents grossissements ont été utilisés, allant généralement de ✕ 60 à ✕ 400.

9La lecture des dépôts de cément s’est faite sans avoir connaissance des données historiques de manière à ne pas influencer l’observateur. Trois lectures successives (étalées dans le temps) ont été effectuées, et les résultats obtenus comparés entre eux.

  • 241 C’est dans ce but que, parallèlement à cette étude, nous avons entrepris la réalisation d’une série (...)

10Les limites de la méthode concernent essentiellement le choix de l’échantillon. Il est indispensable de choisir, pour ce type d’analyse, des dents bien conservées. Pour ce qui est des spécimens archéologiques, il sera utile de prélever, chaque fois que cela s’avérera possible, des dents encore incluses dans la mandibule (ou maxillaire) de manière à s’assurer que le cément n’a pas été altéré. Par ailleurs, un problème de résorption cémentaire peut s’observer parfois, en cas de pathologies, également au niveau des dents en hyperfonction occlusale qui, de ce fait, sont soumises à des polymicrotraumatismes répétés. Ce phénomène peut empêcher l’observation des dépôts. Il est très important de travailler parallèlement sur des séries de référence modernes afin de mieux cerner les éventuels problèmes de cémentogenèse241.

11Toutes les dents étudiées ont été prélevées dans l’os mandibulaire ou maxillaire. Le cément étant arraché par plaques sur la majorité des dents (l’état de conservation des squelettes était mauvais dans la plupart des cas), seuls vingt-sept restes dentaires, provenant de vingt-trois sujets, ont été retenus pour cette analyse. Les résultats obtenus doivent être considérés, au stade actuel de notre travail, comme des résultats préliminaires. En effet, l’homme est un mammifère un peu particulier dans le règne animal. Si sa physiologie est étroitement liée aux grands rythmes biologiques, il a parfois appris à se soustraire à certaines des contraintes de son environnement (climat, stress nutritionnel, par exemple). Il est donc nécessaire, dans le cadre d’un travail scientifique, de contrôler, sur des séries de référence importantes, que la périodicité du dépôt peut être, systématiquement, interprétée en termes de donnée saisonnière. De ce point de vue, la série des Fédons constitue une très bonne série expérimentale. La poursuite de nos recherches dans ce domaine devrait permettre de perfectionner et fiabiliser ce type d’analyse ainsi que les résultats qu’elle permet d’obtenir.

12Pour la majorité des lames minces, il n’a pas été possible de déchiffrer le dernier dépôt de cément à cause de nombreuses zones d’arrachement qui rendaient la lecture impossible. Les onze lames qui se sont prêtées à une analyse correcte du dernier dépôt ont montré que les onze individus sont morts au cours de la période estivale. Il n’a pas été possible d’être plus précis dans la lecture du dernier dépôt ; nous ne pouvons donc pas dire si les décès sont survenus en début, milieu ou fin de la période estivale.

13Les observations réalisées sur les restes dentaires des Fédons ont fait apparaître que le cément radiculaire était, dans la plupart des cas, extrêmement altéré, rendant la lecture des dépôts difficile voire impossible. Cependant, dans 11 cas sur 27 (soit dans 41 % des cas), il a été possible de définir la période du décès.

14Notons qu’aucune différence relative à la « qualité » de la lecture des dépôts n’est apparue entre les sujets féminins et masculins.

15Les 11 sujets qui se sont prêtés à une bonne lecture du dernier dépôt de cément dentaire sont décédés au cours de la bonne saison, c’est-à-dire au cours de la période estivale qui s’étend approximativement entre fin avril/début mai et fin décembre. Il n’a pas été possible de préciser s’il s’agissait, selon les cas, du début, du milieu ou de la fin de celle-ci.

16Comme les textes historiques placent la mort de tous les sujets de ce cimetière entre le 15 mai et le 15 septembre 1590, il apparaît que nous avons donc obtenu 100 % de résultats corrects sur les dents étudiées. Bien que la précision de la méthode ne permette pas d’inscrire les échantillons dans une fourchette inférieure à 8 mois, nettement moins satisfaisante ici que les informations issues des archives, cette expérimentation démontre les potentialités de cette méthode pour des séries moins bien documentées.

17Ce nouveau type d’investigation se révèle donc prometteur. D’autres séries expérimentales où la saisonnalité du décès est connue sont actuellement à l’étude et permettront de valider la méthode et de mieux préciser ses divers champs d’application. L’âge et la saisonnalité des décès ayant une importance toute particulière en démographie historique, le décompte des anneaux du cément dentaire pourrait donc, après validation complète de la méthode, offrir des solutions fiables pour un matériel anthropologique se rapportant à des périodes ou des lieux où aucun enregistrement n’était effectué.

H. M.

L’apport de la biologie moléculaire

18L’utilisation des techniques de biologie moléculaire dans le domaine de l’archéologie des maladies infectieuses a pris son essor au début des années 1990 (Salo et al., 1994 ; Spigelman et Lemma, 1993 ; Rafi et al., 1994). Une première conférence internationale sur ce thème (Archaeology of Emerging Diseases) a été organisée à Jérusalem, en mai 1997, par des microbiologistes et des anthropologues, où l’intérêt de l’approche paléoépidémiologique des infections humaines anciennes a été souligné (Dutour et al., 1998). Désormais, la nature de l’agent infectieux de nombreuses maladies épidémiques peut être identifiée par les techniques de biologie moléculaire (Spigelman et al., 1999 ; Faerman et al.,1999 ; Zink et al., 1999, Dutour et al., 1999 ; Palfi et al., 1999). Les apports des outils moléculaires pour une meilleure connaissance de Yersinia pestis et de son évolution sont en évolution constante (Drancourt et al., 1998 ; Carniel, 1999 ; Achtman et al., 1999 ; Raoult et al., 2000).

19Dès 1994, cette problématique était posée à propos de la peste lors de la fouille du charnier de l’Observance (Marseille, épidémie de peste de 1720-1722). L’accent avait été mis, lors de la programmation des opérations de terrain, sur la nécessité d’associer une recherche de biologie moléculaire à l’ensemble des études pluridisciplinaires qui seraient menées sur ce site. En effet, nous avions souligné qu’un tel matériel constituait un véritable modèle expérimental pour les recherches sur l’ADN de pathogènes anciens puisqu’il réunissait trois conditions uniques dans ce domaine : certitude du diagnostic, large échantillonnage, absence de risque de contamination par les expérimentateurs associés à une parfaite définition chronologique (Dutour et al., 1994). Dans la suite des premiers résultats positifs inédits sur le Yersinia pestis, cette technique nouvellement mise au point, en collaboration dans l’Unité des Rickettsies de D. Raoult, par G. Aboudharam et M. Drancourt sur le matériel de l’Observance (Aboudharam, 1995 et 2001), fut appliquée en 1997 sur le matériel des Fédons au titre de l’authentification du site comme cimetière de peste.

20Dans un premier temps, nous avions demandé à l’équipe présente sur le terrain de prélever les métatarsiens les mieux conservés, sans distinction d’âge, afin de réaliser un protocole classique d’extraction d’ADN. Cependant, une réflexion conduite entre les équipes d’anthropologues et de microbiologistes a abouti à une démarche plus originale de mise au point d’un protocole d’extraction d’ADN microbien à partir de résidus de pulpe dentaire. Ce protocole appliqué initialement avec succès sur la série de l’Observance a permis une identification de l’agent causal de la peste.

21La pulpe dentaire constitue en effet un matériel particulièrement intéressant, à la fois résistant à l’état résiduel dans les dents anciennes et préservé du milieu extérieur, tant pour la contamination par les germes telluriques que pour les phénomènes de lessivage et de percolation ; ce qui autorise l’application de protocoles d’extraction sans décalcification. Ces particularités de la pulpe dentaire la rendent plus intéressante que le matériel osseux, actuellement le plus souvent utilisé dans les travaux de paléomicrobiologie. La pulpe dentaire constitue enfin un échantillon de choix pour les maladies infectieuses septicémiques, ne donnant pas de lésions osseuses.

22À partir de l’hypothèse du transport des bactéries jusqu’à la pulpe dentaire (Drancourt et al., 1998), nous avons recherché un fragment du gène pla (plasminogen activator) spécifique de Yersinia pestis à partir de l’ADN pulpaire par Polymerase Chain Reaction (PCR).

23Des squelettes d’individus jeunes présentant éventuellement des dents incluses ont été sélectionnés. Plusieurs types de dents ont été étudiés : des dents non solidaires, des dents persistantes, des dents incluses. La localisation de ces dernières a été permise par radiographie. Avant toute utilisation, les pièces ont été numérotées, mesurées, photographiées et radiographiées de telle sorte que l’on puisse disposer de toutes ces données lors d’études ultérieures.

24Les dents sélectionnées ont été isolées dans des tubes Falcon stériles. Elles ont été fracturées suivant leur plus grand axe pour avoir accès à la plus grande partie du système canalaire. Dans un environnement stérile, une ou plusieurs amorces de trait de fracture ont été effectuées à l’aide d’un disque à séparer en carborundum. Les dents ont ensuite été fracturées à l’aide d’un élévateur. Des excavateurs (Hu-Friedy Ll) ont été utilisés pour récupérer les restes de pulpe. Ils ont été recueillis dans des tubes Eppendorf stériles.

25À partir des restes pulpaires recueillis, l’ADN pulpaire a été extrait par protocole phénol chloroforme.

26Pour l’amplification génique, deux jeux d’amorces : Yp12R/Yp13D et Yp10R/Yp11D, ont été déterminés à partir de la séquence du plasmide pPCP1 (Sodeinde et Goguen, 1989). Cinq µl d’échantillon d’ADN pulpaire ancien ont été amplifiés dans 25 µl de mélange réactionnel comprenant 15 pmol de chaque amorce, 200 µm de chacun des désoxynucléotides (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 1,25 U de Taq polymérase (Boehringer), 2 mg de BSA (Boehringer).

27Les conditions ont été les suivantes : dénaturation de 1,30 minute à 95 °C suivie de 40 cycles comprenant une étape de dénaturation de 30 secondes à 95 °C, puis une étape d’hybridation 30 secondes à 53 °C et une étape d’élongation de 1 minute à 72 °C.

28La recherche d’un fragment du gène pla (plasminogen activator) spécifique de Yersinia pestis a permis d’observer plusieurs amplicons positifs présentant 100 % d’homologie avec la séquence contemporaine de Yersinia pestis et permettant d’établir un diagnostic rétrospectif de peste pour le site des Fédons. Toutefois, si la « Polymerase Chain Reaction » (PCR) est une méthode hautement sensible pour la détection de l’ADN, le risque de contamination croisée des échantillons à étudier par des produits d’amplification est également reconnu et peut introduire un doute dans l’étude menée par ce type d’approche (Aboudharam et al., 2001). Les problèmes techniques sont multiples (Cooper et al., 2000)

  • Éviter toute contamination de l’ADN ancien par de l’ADN moderne. Ainsi, il est préférable que l’extraction de l’ADN et de la PCR se fassent dans un laboratoire qui ne sert pas pour des recherches en biologie moléculaire.

  • La décontamination des échantillons est essentielle afin que les amorces les plus spécifiques de Yersinia pestis ne se lient pas à d’autres bactéries contaminantes.

  • L’existence de conditions extérieures défavorables à la conservation bactérienne, par la quantité réduite de l’ADN de Yersinia pestis.

  • Un malheureux hasard dans le choix des échantillons faisant que ceux retenus auraient été extraits d’individus dont la mort aurait été provoquée par d’autres causes pendant l’épidémie.

29Afin de limiter certains de ces problèmes, notamment ceux liés à une contamination des échantillons, nous avons récemment développé une amplification « suicide » utilisant des amorces n’ayant jamais été utilisées auparavant d’une manière générale et dans le laboratoire de l’Unité des Rickettsies de Marseille en particulier. Cette amplification a été réalisée en l’absence de témoin positif (Raoult et al., 2000 ; Aboudharam et al., 2001).

30Cette procédure « d’amplification suicide » a été appliquée à de la pulpe dentaire collectée dans des restes humains contemporains de la Peste noire. Un unique amplicon de 133 bp a été obtenu en utilisant comme cible un fragment du gène pla. La comparaison avec un isolat contemporain de Yersinia pestis a permis d’établir 100 % d’homologie avec celui-ci. L’utilisation de « l’amplification suicide » constitue donc une approche prometteuse pour éviter toute contamination génétique et pour permettre de faire une détection moléculaire sans aucune ambiguïté d’agents pathogènes dans des échantillons anciens et modernes.

31Au côté de méthodes classiquement mises en œuvre dans les études anthropologiques, une collaboration avec d’autres disciplines a pu s’instaurer dans le cadre de l’analyse post-fouille de la série ostéoarchéologique des Fédons. Ces études, extrêmement spécialisées, viennent confirmer la saison du décès et la nature pesteuse de l’épidémie. Il est vrai qu’au regard des données de terrain et des éléments issus des archives historiques, on pourrait se demander quel est l’intérêt de développer des analyses aussi lourdes pour l’obtention d’informations que l’on avait déjà obtenues par ailleurs. Mais c’est là, sans doute, que la collaboration interdisciplinaire prend toute sa valeur. Au-delà d’une simple confirmation de la saison et de la cause du décès, ces nouvelles techniques ont besoin, dans un premier temps, d’acquérir une expérience et de valider leurs méthodologies dans un cadre connu. Ensuite seulement, elles pourront porter sur des périodes plus anciennes, venant alors au secours de l’archéologie et de l’anthopologie de terrain pour une authentification de cadre chronologique et épidémiologique. En ce qui concerne les analyses de biologie moléculaire par exemple, leur apport futur ne se limitera pas seulement à la confirmation de contextes archéo-anthropologiques, puisque par typage des biovariants des échantillons anciens, elles permettront également de connaître les mécanismes de répartition géographique et d’évolution des différentes souches de Yersinia pestis et de déterminer la responsabilité éventuelle des biovariants modernes dans les épidémies du passé (Achtman et al., 2001).

M. D., G. A., M. S. D. R., O. D.

Notes

239 La terminologie utilisée ici est celle définie au colloque de Bondy, en 1992, par J. Castanet, F. Meunier, H. Francillon-Vieillot (in Baglinière et al., 1992).

240 Le cément s’est révélé souvent altéré en surface, voire arraché par plaques. L’observation des dépôts de cément nécessitant la réalisation de lames minces, les dents ont été imprégnées, sous vide, avec une résine translucide. Puis elles ont été partagées en deux à l’aide d’une scie à vitesse rapide. Dans la meilleure des deux moitiés a été coupée une « tranche » de dent qui a été ensuite collée sur une lame de verre. Les lames ainsi réalisées ont été amincies sur un tour et polies finement. Soulignons qu’il n’y a pas d’épaisseur vraiment standard, celle-ci pouvant aller de 40 à 100 microns. Les lames ont été polies progressivement jusqu’à obtention d’une bonne lecture des dépôts. Dans un souci de vérification, nous avons parfois réalisé deux lames dans une même dent, et aussi coupé deux dents d’une même mandibule ou maxillaire.

241 C’est dans ce but que, parallèlement à cette étude, nous avons entrepris la réalisation d’une série de référence à partir de dents issues de sujets d’âge et de date de mort connus. Pour ce faire, nous travaillons en collaboration avec le Laboratoire de médecine légale de Toulouse (dir. Pr D. Rougé).

Auteurs

© CNRS Éditions, 2005

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