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Les installations artisanales romaines de Saepinum

 | 
Jean-Pierre Brun
, 
Martine Leguilloux

Chapitre 5. Analyses chimiques des cuves 6 et 7

Nicolas Garnier

Texte intégral

1Deux approches ont été mises en œuvre afin d’étudier la composition chimique totale de la matière organique potentiellement conservée par imprégnation des parois poreuses des cuves 6 et 7, les seules qui ont été découvertes par les fouilles récentes. Trois échantillons ont été soumis à une analyse des résidus organiques. Deux proviennent de la cuve 6 (enduit de la paroi et fond), un autre a été prélevé sur l’enduit de la cuve 7.

2Chaque échantillon a été analysé de façon globale par l’étude de sa fraction dite libre, à savoir l’étude des constituants chimiques directement extractibles par des solvants organiques. Les prélèvements bruts ont aussi été soumis à une réaction de saponification afin d’extraire les composés organiques présents sous forme polymérisée et de plus haut poids moléculaire. Cet extrait hydrolysé a ensuite été purifié et séparé en différentes fractions par chromatographie sur colonne de silice. Chaque extrait ou fraction a été analysé en chromatographie en phase gazeuse haute résolution couplée à la spectrométrie de masse en mode impact électronique (HRGC-EIMS). Les saponifiats fractionnés ont fait l’objet de plusieurs types de dérivation, triméthylsilylation classique, mais aussi méthylation ou acétylation afin de mieux pouvoir identifier les composés par comparaison aux bases de données spectrales.

Préparation des échantillons

Extraction

3Aucun des prélèvements ne présentait de macro-restes organiques. Ils se présentaient sous forme de fragments grisâtres friables et poreux. Les extraits lipidiques ont été obtenus après broyage des prélèvements à l’aide d’un broyeur mécanique IKA A-11 basic. La poudre recueillie a été extraite par un mélange dichlorométhane/méthanol (1 :1 v/v, 20 mL, 20 min aux ultrasons). La phase organique (solvant + extrait) a été séparée de la phase minérale (tesson broyé) par centrifugation (20 min à 2000 tr/min, puis 20 min à 4100 tr/min). Après évaporation à sec sous courant d’azote (40 °C), le résidu organique a été repris dans 1 mL de dichlorométhane.

Dérivation

4Les molécules dites « polaires » (acides, alcools, amines) doivent être dérivées avant d’être injectées sur la colonne séparative de chromatographie, au risque de dégrader celle-ci irrémédiablement. Les groupements chimiques sont transformés en des groupes triméthylsilyles notés TMS, moins polaires, par réaction de triméthylsilylation.

5250 μL de l’extrait précédent ont été prélevés, évaporés à sec et dérivés par un mélange pyridine (5 μL) et BSTFA (N, O-bis(triméthylsilyl) trifluoroacétamide, 50 μL) à 80 °C pendant 20 min. Après évaporation sous courant d’azote à 40 °C, l’extrait organique triméthysilylé est repris dans 100 μL de dichlorométhane.

Analyse en HRGC-EIMS

61 μL de l’extrait dérivé est injecté pour l’analyse en HRGC-MS dont les caractéristiques sont : chromatographe Thermo GCTrace, colonne Zebron-5MS 20 m × 0.18 mm diam. interne × 0.1 μm phase greffée, gaz vecteur hélium 120 kPa (8 min) ; 240 kPa (4 kPa· min-1, 5.0 min) ; injecteur en mode splitless maintenu à 280 °C ; programmation en température : 50 °C (8 min) ; 350 °C (10 °C.min-1, 5.0 min). Le chromatographe est couplé à un spectromètre de masse Thermo DSQII. La source est maintenue à 200 °C. Les analytes sont ionisés par impact électronique avec un faisceau d’électrons d’énergie 70 eV. L’analyseur quadripolaire balaie la gamme de masse 50-800 amu à 9300 amu/s, soit 7 spectres par seconde.

Saponification et purification

7Les fragments prélevés sont directement saponifiés par une solution de KOH 0.5 m dans le méthanol à 50 %, au reflux pendant 1 h. Le tesson est séparé de la phase liquide. Le méthanol est évaporé sous courant d’azote, la solution acidifiée (200 μL H2SO4 98 %). Les constituants organiques sont extraits par le dichlorométhane (3 × 1 mL). Les phases organiques combinées sont lavées à l’eau (3 x 1 mL), séchées sur sulfate de magnésium, évaporées à sec, puis reprises dans le DCM (100 μL). Les stérols sont purifiés par extraction en phase solide sur colonne Sep-Pak aminopropyle. La fraction neutre est éluée par un mélange DCM/ i-PrOH, la fraction acide par une solution d’acide acétique à 5 % dans le DCM. Les fractions sont évaporées à sec sous courant d’azote, dérivées par triméthylsilylation (mélange Py : BSTFA, 5 :50 μL, 80 °C, 30 min), évaporées à sec sous courant d’azote (40 °C), puis reprises dans 100 μL de dichlorométhane.

Résultats

Enduit de la cuve 6

8La fraction extractible est riche en composés organiques appartenant à différentes familles chimiques (fig. 120 haut) :

  • acides gras : de distribution large (9 :0 à 24 :0), ils sont à dominance pairs, dominés par l’acide palmitique (16 :0). La proportion d’acides gras insaturés est particulièrement importante pour un échantillon ancien : on trouve l’acide palmitoléïque (16 :1) et deux isomères de l’acide oléique (18 :1). Une telle proportion d’acides insaturés provient d’huiles végétales. Ces acides se retrouvent aussi dans la composition des monoglycérides (notés MAG sur les figures) préservés.
  • les alcools aliphatiques à longue chaîne (C16 à C34) sont dominés par le C26. Cette large distribution est caractéristique de produits végétaux.
  • les stérols proviennent de diverses origines : animales de par la présence du cholestérol à 27 atomes de carbone, et végétales comme l’indique leur association aux phytostérols à 29 atomes de carbone.
  • les diterpènes ne sont représentés que par l’acide déhydroabiétique (noté DAB), marqueur des résines de conifères, très stable dans le temps. De telles traces peuvent provenir de pollutions dues au milieu environnant (eaux d’infiltration provenant d’un sol où poussent quelques espèces résineuses, pins, mélèzes, etc.).
  • les triterpènes sont les composés les plus pertinents de la fraction (fig. 121). Ce sont cependant des marqueurs complexes qu’il est souvent difficile d’identifier en raison de leurs fortes analogies structurales et du manque de bases de données vraiment exploitables (handbooks, articles...). Outre la β-amyrénone, composé d’oxydation de la β-amyrine ubiquiste dans le règne végétal, on trouve le cycloarténol et le 24-méthylènecycloartanol assez abondant. Ces marqueurs sont caractéristiques des huiles végétales et se retrouvent notamment dans l’huile d’olive conservée en contexte archéologique (cf. étude du contenu des amphores Dressel 20 et Africaine I à Arles : Garnier et al. 2011). La présence du fucostérol et surtout du squalène, hydrocarbure polyinsaturé caractéristique de l’olive, vient appuyer l’hypothèse de l’huile d’olive.
  • une série de cét-2-ones à longue chaîne, à prédominance impaire, du C25 au C33, est présente malgré un signal assez faible. Ces composés, absents des végétaux, se forment lors de la combustion des espèces feuillues, par décomposition thermiques des cires végétales notamment. On les retrouve donc comme constituants principaux des cendres.

Fig. 120. Chromatogrammes de la fraction soluble (solvant DCM/MeOH 1 :1 v/v, en haut), et de la fraction saponifiée (en bas), obtenues à partir de l’enduit de la cuve 6, après triméthylsilylation.

9L’olive, ou son huile, n’ont pas été les seuls contenus de cette cuve. On note la présence d’acide p-hydroxybenzoique et d’acide 3-hydroxy-4-méthoxycinnamique (fraction saponifiée), et surtout des ω-hydroxyacides. Ces derniers, dominés par l’acide phellonique ou ω-OH 22 :0, sont des marqueurs caractéristiques des écorces (Duke 1989, p. 253). Leur association avec les acides phénoliques montre l’utilisation d’écorces d’arbres feuillus. Cependant le chêne n’est pas un candidat retenu car, très riche en triterpènes, son marqueur principal, la friedeline, aurait été détecté.

Prélèvement au fond de la cuve 6

10L’échantillon prélevé au fond de la cuve présente un profil assez semblable à celui de l’enduit, tant pour la distribution des acides gras, des mono- et diglycérides, que des stérols et des triterpènes. Il se différencie uniquement par la présence d’esters à longue chaîne (cires végétales) et de nombreux acides gras hydroxylés ou cétoniques à courte chaîne carbonée, éluant entre 12 et 24 min. Ces composés sont des métabolites, produits de dégradation d’autres molécules organiques utilisés comme nutriments par les microorganismes du sol. Le prélèvement comprend aussi la même série de cét-2-ones que l’enduit, confirmant la présence de cendres végétales.

11La fraction saponifiée apporte des informations supplémentaires (fig. 122 en bas) :

  • la distribution plus large des acides gras, allant jusqu’au 26 :0, correspond à des cires végétales. De même, la présence de très nombreux composés de pic de base à m/z 205, caractéristiques de polyalcools comportant au moins deux fonctions alcool vicinales en position 1 et 2. Ils entrent dans la composition des subérines provenant des fragments végétaux ligneux.
  • la très forte proportion d’acides gras insaturés, notamment les acides palmitoléique (16 :1) et oléique (18 :1) et leurs isomères, montrent la présence d’une huile végétale fortement insaturée et bien conservée. Les acides gras impairs, linéaires et ramifiés, relativement abondants, indiquent une graisse d’un animal ruminant, dont l’origine animale est corroborée par la présence de cholestérol.

Fig. 121. Détail du profil des stérols et des triterpènes contenus dans la fraction soluble (solvant DCM/MeOH 1 :1 v/v) triméthylsilylée de l’enduit de la cuve 6.

12Une seconde méthode de dérivation, par perméthylation des fonctions polaires, a été testée afin de mieux identifier les nombreux composés mineurs. Or, cette méthode de dérivation a révélé de nombreux autres marqueurs de masse molaire paire et fragments impairs, soit des molécules comportant un atome d’azote. Si les principaux marqueurs ont pu être identifiés, comme la β-phénylalanine ou des pipérazines, les très nombreux pics minoritaires n’ont pas été élucidés plus en détail, par manque d’exhaustivité des banques de données spectrales. En revanche, on note que la très grande variété de composés azotés détectés montre la présence d’une source protéique fortement dégradée par des (micro)organismes. L’analyse des imprégnations de l’enduit et du contenu de la cuve 6 indique que plusieurs matériaux biologiques ont été contenus : une huile végétale probablement d’olive, mais aussi des matériaux gras animaux, vraisemblablement d’animaux ruminants, et enfin des écorces d’arbres feuillus.

13La très forte concentration en squalène, qui peut être associée à l’olive comme aux peaux à sebum, irait dans le sens d’un travail de peaux animales dans un bain d’écorces. Les composés azotés, produits de dégradation des acides aminés constitutifs des protéines, apportent là aussi un élément en faveur des peaux. L’huile végétale peut correspondre à une autre phase d’utilisation.

14La cuve 6 semble donc présenter deux phases d’utilisation : une première correspondant à un contenu basique, un matériau gras d’origine animale, riche en protéines, et des écorces d’arbres feuillus. Le milieu basique aurait aussi favorisé l’extraction des Ω-hydroxyacides caractéristiques des écorces. On peut penser à un trempage de peau dans un mélange de cendres végétales et d’écorces d’espèces feuillues (autres que le chêne). La cuve n ° 6 aurait ensuite servi à contenir de l’huile d’olive dont subsistent les marqueurs acides et neutres.

Fig. 122. Chromatogrammes de la fraction soluble (solvant DCM/MeOH 1 :1 v/v, en haut) et de la fraction totale saponifiée (en bas), obtenue à partir du prélèvement effectué au fond de la cuve 6, après triméthylsilylation.

Enduit de la cuve 7

15Le prélèvement se présentait sous forme de fragments grisâtres friables et poreux. La fraction extractible est peu concentrée en matière organique et se compose essentiellement (fig. 123) :

16- de nitriles dérivés des acides gras 18 :0 et 18 :1 (acides stéarique et oléique), 20 :1 (acide eicosénoique) et surtout 22 :1 (acide érucique). Ces composés ne proviennent pas de la réaction des acides gras libres sur des composés azotés de type ammoniac, formant un sel (le carboxylate d’ammonium RCOONH 4), qui se déhydrate par chauffage pour donner une amide (RCONH 2) puis un nitrile (RCN). Ces deux réactions successives ne sont pas envisageables en milieu naturel. En revanche, les nitriles à longue chaîne carbonée sont utilisés comme plastifiants dans l’industrie chimique.

17- des amides primaires dérivées des acides 20 :1 et 22 :1 principalement. Elles sont utilisées dans l’industrie chimique, en association avec les nitriles correspondants.

18À l’heure actuelle, ces deux classes de molécules sont interprétées comme tel (confirmation par Silvia Bruni, de l’université de Milan).

19- le squalène : dans les trois extraits, il est un des marqueurs majoritaires, voire le marqueur le plus abondant. Il provient du sébum de la peau, de l’olive, de la datte ou du foie de requin. Aucune étude ne s’est encore penchée sur la distribution et la quantification du squalène dans les différentes peaux : en contexte archéologique, il est généralement interprété comme une pollution suite à la manipulation des échantillons à main nue. Dans ce cas, le manipulateur dépose du squalène et les autres molécules présentes sur sa peau (acide palmitique, acide stéarique, cholestérol principalement) sur l’objet touché. Ici, aucun acide gras n’est détecté, sinon à l’état de traces. Cela tendrait à montrer que le squalène n’a pas été apporté par une manipulation récente, mais a bien imprégné les parois de la cuve. L’hypothèse de peau (animale) peut être avancée.

20- les alcools aliphatiques à longue chaîne (C16 à C34) dominés par le C26, en faible proportion. Leur large distribution est caractéristique de produits végétaux (cires végétales).

21- les acides gras : quasi absents, leur distribution très étroite peut être rapprochée d’une source animale, mais leur conservation à l’état de trace ne permet pas d’interprétation valide. Leur absence pourrait être expliquée par un milieu basique : les acides gras sont alors ionisés en leurs sels, les ions carboxylates RCOO-, très solubles et facilement lessivés. Si telles étaient les conditions de milieu, le milieu basique a provoqué en amont l’hydrolyse des graisses (triglycérides) en carboxylates (réaction de saponification).

22- une série de cét-2-ones à longue chaîne, à prédominance impaires, du C27 au C33, indique des cires végétales dégradées thermiquement, à savoir des végétaux brûlés ou des cendres.

23- les stérols, essentiellement du cholestérol à 27 atomes de carbone. L’origine animale est confirmée. Étant donné la proportion des stérols animaux (C27) par rapport aux stérols végétaux (C29), l’on peut avancer qu’un matériau gras animal a été contenu dans la cuve, alors que les phytostérols, très peu abondants, relèvent plutôt d’une contamination post-dépositionnelle (en accord avec les cires végétales et les n-alcools).

Fig. 123. Chromatogrammes de la fraction soluble (solvant DCM/MeOH 1 :1 v/v, en haut) et de la fraction totale saponifiée (en bas), obtenue à partir du prélèvement effectué au fond de la cuve 7, après triméthylsilylation.

24Aucune trace de friedeline (pics caractéristiques à m/z 426 et 320), marqueur du chêne, n’a été détectée. Contrairement à la cuve 6, aucun triterpène de l’olive n’est détecté (cycloarténol, uvaol, etc.), ce qui exclut que le squalène provienne de l’huile d’olive, comme en partie pour l’échantillon précédent.

25La cuve 7 a contenu un matériau gras animal. Étant donné la très forte teneur en squalène et la relative préservation de l’enduit vis-à-vis des contaminations, le squalène aurait été apporté par le contenu. On peut supposer un matériau sébacé, c’est-à-dire une peau.

26La perte sélective des acides gras montrerait que le milieu a été maintenu à un pH basique, favorisant leur perte par ionisation. La cuve 7 pourrait correspondre à la phase du « travail de rivière » et aux différents rinçages successifs, notamment le pelanage où la peau est mise à tremper avec de la chaux. Les marqueurs de cette étape relargués par la peau sont le cholestérol et le squalène, car tous les acides gras de la peau sont éliminés par dissolution en raison du milieu très basique.

Table des illustrations

Légende Fig. 120. Chromatogrammes de la fraction soluble (solvant DCM/MeOH 1 :1 v/v, en haut), et de la fraction saponifiée (en bas), obtenues à partir de l’enduit de la cuve 6, après triméthylsilylation.
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Légende Fig. 121. Détail du profil des stérols et des triterpènes contenus dans la fraction soluble (solvant DCM/MeOH 1 :1 v/v) triméthylsilylée de l’enduit de la cuve 6.
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Légende Fig. 122. Chromatogrammes de la fraction soluble (solvant DCM/MeOH 1 :1 v/v, en haut) et de la fraction totale saponifiée (en bas), obtenue à partir du prélèvement effectué au fond de la cuve 6, après triméthylsilylation.
URL http://books.openedition.org/pcjb/docannexe/image/5496/img-3.jpg
Fichier image/jpeg, 99k
Légende Fig. 123. Chromatogrammes de la fraction soluble (solvant DCM/MeOH 1 :1 v/v, en haut) et de la fraction totale saponifiée (en bas), obtenue à partir du prélèvement effectué au fond de la cuve 7, après triméthylsilylation.
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