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Nutzen-Risiko-Bewertung von Mineralstoffen und Spurenelementen

 | 
Andrea Hartwig
, 
Beate Köberle
, 
Bernhard Michalke

Posterbeiträge

Zytotoxische und genotoxische Effekte von Cu(II)-Melanoidin Komplexen

Claudia Keil, Bettina Cämmerer, Michael Koch, Ines Laube, Lothar W. Kroh et Andrea Hartwig

Résumé

Bei Melanoidinen handelt es sich um hochmolekulare Verbindungen, die durch die Reaktion von Aminokomponenten mit reduzierenden Zuckern in der Endphase der Maillard-Reaktion gebildet werden und Bestandteil zahlreicher thermisch behandelter Lebensmittel sind. Diese Substanzen besitzen verschiedenste physiologische Effekte; hierbei standen bislang vor allem ihre antioxidativen Eigenschaften und deren zugrunde liegenden Mechanismen im Fokus des Interesses. Aktuelle Studien weisen allerdings darauf hin, dass Melanoidine, insbesondere nach Bindung von redoxaktiven Metallionen, auch prooxidative Effekte vermitteln. Ziel der vorliegenden Studie war es, den Einfluss von Kupferionen-Komplexierung durch Melanoidine auf die Zytotoxizität und die Induktion von DNA-Schäden in der humanen Kolonkarzinomzellinie HCT-116 zu beurteilen. Nach Inkubation mit reinen D-Glc/L-Ala-Melanoidinen war kein signifikanter Anstieg an Schäden in der genomischen DNA nachweisbar. Auch die Viabilität der Kolonzellen blieb unter Verwendung lebensmittelrelevanter Konzentrationen an reinen Melanoidinen unbeeinflusst. Hingegen resultierte die Inkubation mit Cu(II)-beladenen Melanoidinen in einer deutlichen Induktion von DNA-Strangbrüchen, verbunden mit der vermehrten Expression des Stress-Response-Gens Metallothionein 2A sowie Cytochrom p450 1A1. Einhergehend zeigte sich eine verminderte metabolische Aktivität und verringerte Fähigkeit zur Koloniebildung der HCT116-Zellen nach einer Inkubation mit den Cu(II)-Melanoidin-Komplexen. Des Weiteren konnte in in-vitro Experimenten mit isolierten Nukleinsäuremolekülen eine direkte DNA-schädigende Wirkung der Cu(II)-beladenen Melanoidine gezeigt werden. Zusammenfassend legen diese Befunde nahe, dass ernährungsrelevante Melanoidine neben ihren antioxidativen Eigenschaften im Lebensmittel insbesondere nach Komplexierung von redoxaktiven Metallionen im zellulären System auch prooxidative Eigenschaften besitzen. Weitere Untersuchungen sind notwendig, um die dafür zugrundeliegenden Mechanismen zu klären und zudem die zellulären Auswirkungen einer längerfristigen Exposition mit Cu(II)-Melanoidin-Komplexe zu erfassen.

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Kurztitel: Wirkungen von Cu(II)-Melanoidin Komplexen

Texte intégral

Einleitung

1Melanoidine entstehen als Endprodukte der Maillard-Reaktion, die besonders bei der hitzeinduzierten Be-und Verarbeitung sowie bei der Lagerung von Lebensmitteln abläuft. Ausgangsstoffe sind reduzierende Kohlenhydrate wie Mono-, Di-oder Oligosaccharide, aber auch Polysaccharide wie Stärke oder Zuckerabbauprodukte mit Carbonylgruppen wie Glyoxal oder Furfural sind denkbar. Als Aminokomponente fungieren neben freien Aminosäuren vor allem Proteine, die in ihren Seitenketten freie Aminofunktionen enthalten. Über Amadoriprodukte reagieren sie zu α-Dicarbonylverbindungen, die als Schlüsselintermediate der Maillard Reaktion gelten. Abhängig von den Ausgangsstoffen und den Reaktionsbedingungen werden im weiteren Verlauf der Reaktion eine Vielzahl von erwünschten (z. B. Aromastoffe), aber auch unerwünschten Verbindungen (z. B. heterozyclische aromatische Amine, Acrylamid) gebildet (Abbildung 1) [1, 2]. Melanoidine stellen die tief braun gefärbten höher-bis hochmolekularen Endprodukte der Maillard Reaktion dar. In vielen Lebensmitteln wie Kaffee, Brot und gerösteten Nüssen sind diese Stoffe in teilweise hohen Konzentrationen enthalten (bis zu 30% in Kaffee) [3, 4]. Obwohl ihre Struktur noch weitgehend unbekannt ist -bisher konnten nur einige Inkremente analysiert werden – wurden (oder sind untersucht worden) besonders die antioxidativen Eigenschaften der Melanoidine intensiv untersucht [5]. Zur Quantifizierung der antioxidativen Aktivität stehen verschiedene in-vitro Methoden zur Verfügung [6, 7]. Allerdings sind deren Ergebnisse nicht immer kompatibel. Zur Erklärung der antioxidativen Aktivität der Melanoidine werden verschiedene Mechanismen herangezogen. So sind Melanoidine in der Lage, freie Radikale, ROS oder auch Sauerstoffmoleküle abzufangen, aber auch die Fähigkeit zur Chelatisierung von Metallionen trägt zu den antioxidativen Eigenschaften im Lebensmittel bei [8, 9, 10]. Vom physiologischen Standpunkt aus ergeben sich allerdings deutlich weiterreichende Konsequenzen. So wird z.B. die antimikrobielle Wirkung von Kaffee-und anderen Melanoidinen gegenüber verschiedenen pathogenen Bakterien auf eine irreversible Schädigung der Zellmembran durch die Komplexierung von essentiellen Metallionen zurückgeführt [11]. Auch für die Inaktivierung bestimmter Enzyme werden Chelatisierungseffekte durch Melanoidine postuliert [12]. Durch die Beeinflussung von Löslichkeit und Absorptionscharakteristik kann zudem die Bioverfügbarkeit von Metallionen verändert werden, was einerseits zu einer Beeinträchtigung der Aufnahme essentieller Spurenelemente, zur modifizierten Anreicherung in bestimmten Geweben, aber auch zur verstärkten Ausscheidung führen kann (Abbildung 2) [13, 14]. Die hierzu publizierten Ergebnisse sind allerdings widersprüchlich. Eine Vielzahl von Veröffentlichungen befasst sich mit Untersuchungen zu mutagenen oder genotoxischen Eigenschaften von Melanoidinen in subzellulären Testsystemen, in denen speziell für hochmolekulare Melanoidine keine Aktivität nachgewiesen wurde [15, 16]. Ziel unserer Arbeit war es zu untersuchen, wie sich die im Lebensmittel und in subzellulären Testsystemen nachgewiesenen antioxidativen Eigenschaften der Melanoidine in Zellsystemen auswirken und welchen Einfluss hierbei eine Chelatisierung von Metallionen auf den Redoxstatus von Zellen hat.

Material und Methoden

Zellmodell

2Als Zellmodell wurden humane HCT116-Kolonkarzinomzellen verwendet [17]. Die Kultivierung der Zellen erfolgte als Monolayer in Zellkulturschalen bei 37°C, 5% CO2 und 100% Luftfeuchtigkeit. Die Inkubation der Zellen erfolgte mit den jeweiligen präparierten Melanoidinen oder CuSO4∙7 H2O (Sigma-Aldrich, 99,999%) für 24 h.

Herstellung und Charakterisierung der Melanoidine

3Zur Herstellung der Melanoidine wurde D-Glc und L-Ala in äquimolaren Mengen gemischt und für 20 min bei 170°C im Trockenen erhitzt [18]. Nach einer Dialyse (MWCO 12-14 kDa) gegen destilliertes Wasser oder CuSO4 wurden ungebundene Metalle mittels Ultrafiltration (MWCO 3 kDa) entfernt. Die Lagerung der gefriergetrockneten Melanoidine erfolgte in einem Exsikkator im Dunkeln. Die Charakterisierung der Melanoidine wurde im Hinblick auf ihre antioxidativen und reduzierenden Eigenschaften mittels TEAC-Assay und der Phenanthroline-Methode durchgeführt. Der Gehalt an Metallen wurde durch Graphitrohr-Atomabsorptionsspektroskopie mittels externer Kalibrierung bestimmt [19].

Bestimmung der zytotoxischen Parameter

4Die Bestimmung der zytotoxischen Parameter erfolgte anhand der Erfassung der Zellzahl und der Koloniebildungsfähigkeit [20].

Induktion von DNA-Strangbrüchen in kultivierten Zellen

5HCT116-Zellen wurden nach einer Adhärensphase für 24 h mit den jeweiligen Melanoidinen, Cu-Melanoidin-Komplexen bzw. CuSO4 vorinkubiert und anschließend ggf. für 5 min. mit H2O2 koinkubiert. Das Ausmaß an DNA-Einzelstrangbrüchen wurde mittels Alkalischer Entwindung (AU) quantifiziert [21].

Induktion von DNA-Strangbrüchen an isolierter DNA

6Zur Erfassung der DNA-schädigenden Wirkung an isolierter DNA wurde der PM2-Assay genutzt [22]. Hierfür wurde die isolierte PM2-Phagen-DNA für 1 h mit den jeweiligen Melanoidinen, Cu-Melanoidin-Komplexen bzw. CuSO4 inkubiert. Nach einer anschließenden Trennung von intakter superspiralisierter und geschädigter zirkulärer DNA mittels Agarose-Gelelektrophorese und Detektion durch Ethidiumbromidfärbung erfolgte die Kalkulation der generierten DNA-Strangbrüche.

Genexpressionsanalysen

7Die Genexpressionsanalysen wurden mittels Real-Time-PCR unter Verwendung des SYBR Green RT-PCR Systems durchgeführt. Als Zielgene wurden Cytochrom p450 1A1 (cyp1A1), γ-Glutamylcystein-Ligase (gclc) Glutathion Reduktase (gsr) sowie Metallothionein 2A (mt2A) gewählt. Zur Berechnung wurde das Effizienz-korrigierte relative Quantifizierungsmodell herangezogen [23].

Ergebnisse

8Ziel unserer Arbeiten war es zu untersuchen, wie sich eine Komplexierung von Metallionen auf die antioxidativen Eigenschaften der Melanoidine auswirkt und welche Effekte dadurch an isolierten Nukleinsäuremolekülen und zellulärer DNA hervorgerufen werden. Hierzu wurden zunächst Maillard-Produkte mittels trockener Bräunung aus D-Glukose und L-Alanin als Aminokomponente hergestellt. Durch anschließende Dialyse gegen destilliertes Wasser konnte die hochmolekulare Melanoidin-Fraktion gewonnen werden. Eine Dialyse gegen CuSO4 erlaubte die Generierung von Kupfer-Melanoidin-Komplexen mit einer Absättigung von 106 mg Cu-Ionen/g Melanoidin-Cu-Komplex, bestimmt durch Graphitrohr-Atomabsorptionsspektroskopie. Wurden die gewonnenen Melanoidine mittels TEAC-Assay und Phenanthrolin-Assay untersucht, zeigte sich das stärkste antioxidative Potential bei den Melanoidinen ohne Metallbeladung. Eine Komplexierung mit Cu(II)-Ionen resultierte in einer deutlichen Verringerung dieser Kapazität. Für die Cu(II)-Ionen wurden keine reduzierenden Eigenschaften detektiert. Die Untersuchungen im Rahmen der zellbasierten Zytotoxizitätstest ergaben für die reinen Melanoidine unter Verwendung ernährungsmittelrelevanter Konzentrationen keine negativen Einflüsse. Hingegen zeigten der Cu(II)-Melanoidin-Komplex und CuSO4 sowohl im Hinblick auf die Viabilität als auch die Koloniebildungsfähigkeit der HCT116-Zellen deutlich adverse Effekte. Begleitend dazu wurde eine signifikant erhöhte Expression von Stress-Response Genen wie Cytochrom p450 1A1 (cyp1A1) beobachtet, wohingegen die für die γGlutamylcystein-Ligase (gclc) und Glutathion Reductase (gsr) kodierenden Gene nur geringfügig beeinflusst waren. Des Weiteren waren signifikant erhöhte Mengen von mt2A-Transkripten in HCT-116 Zellen nach Inkubation mit Cu(II)-Komplex und CuSO4 nachweisbar, vermutlich als Schutzmechanismus vor weiterer zellulärer Schädigung. Als ein mögliches zelluläres Target wurde anschließend die genomische DNA auf ihre Schädigung nach Inkubation mit Melanoidin-Komplexen mit und ohne gebundenen redoxaktiven Metallionen untersucht. Im zellulären System resultierte die Inkubation mit reinen Melanoidinen nur in einer geringfügigen Induktion von DNA-Schäden. Im Falle der Cu(II)-Melanoidin-Komplexe hingegen wurden bereits bei Verwendung geringer nicht-zytotoxischer Konzentrationen erhebliche Mengen an DNA-Strangbrüchen in den HCT116-Zellen beobachtet, deren Anzahl sich unter prooxidativen Bedingungen noch weiter erhöhte. Des Weiteren wurde auch an der isolierten PM2-Phagen-Nukleinsäure eine DNA-schädigende Wirkung der Cu(II)-Melanoidin-Komplexe beobachtet.

Diskussion

9Kupfer ist für die meisten Lebewesen ein essentielles Spurenelement und muss daher in geringen Mengen mit der täglichen Nahrung aufgenommen werden. Der menschliche Körper enthält ca. 1,4 bis 2,1 mg pro Kilogramm Körpermaße. Man geht von einem täglichen Kupferbedarf von 1 bis 3 Milligramm aus, der durch eine ausgewogene und abwechslungsreiche Ernährung in der Regel vollständig sichergestellt ist [24]. Die Essentialität ergibt sich aufgrund seiner Funktion als Cofaktor für Enzyme, welche unter anderem in der Eisenhomöostase sowie antioxidativen zellulären Schutzmechanismen involviert sind [25]. Ähnlich wie Kupfermangel kann allerdings auch eine exzessive Zufuhr von Kupfer aufgrund einer Überlastung des antioxidativ wirksamen Zellsystems zu oxidativem Stress und nachfolgend zu Gewebeschäden führen. Freie Kupferionen oder niedermolekulare Kupfer-Komplexe katalysieren Fenton-artige Reaktionen und erzeugen so Hydroxyl-Radikale, die eine oxidative Schädigung von Makromolekülen wie Lipiden, Proteinen und Nukleinsäuren bewirken [26].

10In Übereinstimmung mit anderen Studien [4, 27, 28] zeigen unsere Untersuchungen, dass Melanoidine als wesentlicher Bestandteil von thermisch prozessierten Lebensmitteln in der Lage sind, Kupfer-Ionen in großen Mengen zu komplexieren. Die Bindung der Metalle resultiert in einer deutlichen Verringerung der antioxidativen und radikalfangenden Eigenschaften der Melanoidine, vermutlich aufgrund der Blockierung der dafür zugrundeliegenden funktionellen Gruppen. Im Hinblick auf die biologischen Auswirkungen zeigte sich, dass die reinen Melanoidine in isolierten Nukleinsäuremolekülen geringfügig DNA-Schäden induzieren, möglicherweise begründet durch kleine Mengen an H2O2, die durch die Maillard-Produkte in Gegenwart von Sauersoff generiert werden [29]. Die Viabilität der humanen Kolonkarzinomzellen wurde, wie bereits für andere Maillard-Modelle gezeigt [4], unter ernährungsrelevanten Konzentrationen nicht beeinflusst. Nach Bindung der redoxaktiven Kupfer-Ionen hingegen zeigte sich ein deutlich prooxidatives Potential, verbunden mit der Induktion von DNA-Schäden sowohl in der isolierten PM2-Phagen-DNA als auch in kultivierten HCT116-Zellen. Für Cu(II)-Ionen wurde bei den entsprechenden Konzentrationen eine nur marginale Induktion von DNA-Einzelstrangbrüchen beobachtet. Zum jetzigen Zeitpunkt sind die exakten Mechanismen der Kupferbindung durch die Melanoidine nur unvollständig verstanden. Da Cu(II)-Ionen keine Fenton-Reaktion katalyiseren können, müssen die gezeigten prooxidativen Effekte der Komplexierung der Kupfer-Ionen durch die Melanoidine zugeschrieben werden. Deren verbleibende Reduktionsfähigkeit könnte die Umwandlung von Cu2+ zu redoxaktiven Cu+-Ionen initiieren. Daran anschließende Redoxzyklen und die daraus resultierenden reaktiven Sauerstoffspezies sind als ein wesentlicher Mediator für die durch Kupfer-Melanoidine generierten DNA-Strangbrüche vorstellbar [19]. In weiteren Untersuchungen sollen die für die Erzeugung von ROS zugrundeliegenden Mechanismen geklärt und zudem die zellulären Auswirkungen einer langfristigen Exposition mit Metall-Melanoidin-Komplexen erfasst werden.

Abbildung 1: Übersicht zur Maillard-Reaktion.
AGE: Advanced glycation end products; HAA: Heterocyclic Aromatic Amine; R-CHO: Strecker aldehydes

Abbildung 2: Eigenschaften und postulierte biologische Wirkungen von Melanoidinen.

Bibliographie

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Table des illustrations

Légende Abbildung 1: Übersicht zur Maillard-Reaktion.AGE: Advanced glycation end products; HAA: Heterocyclic Aromatic Amine; R-CHO: Strecker aldehydes
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Légende Abbildung 2: Eigenschaften und postulierte biologische Wirkungen von Melanoidinen.
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Auteurs

Technische Universität Berlin, Institut für Lebensmitteltechnologie und Lebensmittelchemie, Fachgebiet Lebensmittelanalytik, TIB 4/3-1,Gustav-Meyer-Allee 25, 13355 Berlin
Karlsruher Institut für Technologie (KIT), Abteilung für Lebensmittelchemie und Toxikologie, Adenauerring 20 a (Geb. 50.41), 76131 Karlsruhe
Email: claudia.keil@kit.edu

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