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Nutzen-Risiko-Bewertung von Mineralstoffen und Spurenelementen

 | 
Andrea Hartwig
, 
Beate Köberle
, 
Bernhard Michalke

Vortragsreihe

Zink beeinflusst den zellulären Redoxstatus und die Basenexzisionsreparatur (BER)

Elisa Schulze, Claudia Keil, Julia Schrank, Jürgen Zentek et Andrea Hartwig

Note de l’éditeur

Kurztitel: Zink, oxidativer Stress und DNA-Reparatur

Texte intégral

Einleitung

Biochemische Funktionen von Zink

1Das Spurenelement Zink ist essentiell für den Menschen. Der Gesamtkörperbestand an Zink beträgt etwa 2-4 g; die Konzentration im Plasma liegt bei 11-20 µM. Zink ist Bestandteil von mehr als 3000 Proteinen, einschließlich 1000 Enzymen. Zinkabhängige Enzyme sind in allen sechs Enzymklassen (Oxidoreduktasen, Transferasen, Hydrolasen, Lyasen, Ligasen und Isomerasen) vertreten, wobei Zink innerhalb dieser Proteine sowohl katalytische Funktionen (z.B. Carboanhydrase) als auch strukturelle Funktionen (z.B. Alkoholdehydrogenase) einnimmt. Zink ist u.a. an der Ausbildung sogenannter Zinkfingerstrukturen beteiligt. Dabei wird ein Zinkatom durch vier Cysteine und/oder Histidine komplexiert und schafft damit die Voraussetzung für Protein-Protein-bzw. DNA-Protein-Wechselwirkungen. Zink-bindende Domänen sind beispielsweise Bestandteil von Transkriptionsfaktoren (u.a. TF IIIA), DNA-Reparaturproteinen (u.a. XPA, PARP) und dem Tumorsupressorprotein p53.

2Damit ist Zink an zahlreichen zellulären Prozessen, die an der Aufrechterhaltung der genomischen Stabilität mitwirken, wie der Zellproliferation und - differenzierung, an zellulären Signalwegen, an der antioxidativen Abwehr, an der DNA-Reparatur sowie an der Genexpression beteiligt [zusammengefasst in 1, 2]

Zinkhomöostase

3Die Zinkhomöostase wird vorwiegend über die Resorption im Dünndarm und über die Ausscheidung reguliert. Ungefähr 15-40% des aufgenommenen Zinks werden im Jejunum und Ileum resorbiert. Die Ausscheidung erfolgt zu ca. 90% über die Galle und das Pankreassekret. Die Zinkhomöostase ist streng reguliert und wird über Zink-Importproteine (ZIP 1-14), Zink-Exportproteine (ZnT 1-10) und Zink-Speicherproteine aufrechterhalten. ZIPs fördern den Einstrom in die Zelle und aus Vesikeln (z.B. Endoplasmatisches Retikulum) heraus und erhöhen damit die intrazelluläre Zinkkonzentration. ZnTs dagegen erniedrigen die intrazelluläre Zinkkonzentration, indem sie den Ausstrom von Zink in den extrazellulären Raum bzw. die Speicherung in intrazelluläre Vesikel fördern. Metallothioneine (MT) binden das essentielle Spurenelement mit hoher Affinität, können es aber bei Bedarf auch wieder abgeben [3, 4]. Die intrazelluläre Zinkkonzentration beträgt wenige hundert Micromolar, wobei nur picomolare bis niedrige nanomolare Konzentrationen an intrazellulärem Zink „frei“, d.h. an niedermolekularen Bestandteilen gebunden, vorliegen [5]. Diese „freien“ Zink-Ionen sind sehr potente Signale innerhalb der Zelle und können gezielt Proteine und die damit verbundenen biochemischen Prozesse beeinflussen [6].

Redoxstatus der Zelle und die Rolle von Zink

4Der Redoxstatus der Zelle hängt von der Anwesenheit reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) sowie von den zellulären Schutzmechanismen ab. ROS können endogen durch fehlerhaften Elektronentransfer innerhalb der mitochondrialen Atmungskette sowie durch die Aktivierung des Immunsystems generiert werden. Exogene Quellen sind ionisierende Strahlung und redoxaktive Substanzen. Im Gegenzug verfügt die Zelle über verschiedene antioxidative Abwehrmechanismen, wie Antioxidantien (z.B. Ascorbinsäure), Glutathion (GSH) und detoxifizierende Enzyme (z.B. Superoxiddismutase (SOD), Katalase). So werden Superoxidradikalanionen (O2-∙) durch die SOD in H2O2 umgewandelt, welches wiederum durch die Katalase und Glutathionperoxidase (GP) detoxifiziert wird. Ist die Detoxifizierung von H2O2 nicht ausreichend gewährleistet, kommt es durch Reaktionen mit Übergangsmetallionen (z.B. Fe2+, Cu1+) zur vermehrten Bildung von Hydroxylradikalen (∙OH), die neben Proteinen und Lipiden auch die DNA schädigen können. Die Reaktion von ∙OH kann u.a. zu DNA-Einzel- und Doppelstrangbrüchen und oxidativen DNA-Basenmodifikationen, wie z.B. 8-Oxoguanin (8-OxoG) führen [7, 8]. Die Entfernung dieser DNA-Läsionen durch die vorhandenen zellulären Reparaturmechanismen ist für die Integrität der DNA unerlässlich.

5Zink ist redox-inert, da es ausschließlich in der Oxidationsstufe +2 vorkommt. Da jedoch Schwefel-Liganden in Cysteinresten von Proteinen redox-aktiv sind, wird Zink in Zink-Cystein-Clustern redox-regulierbar. Je nach Redoxstatus der Zelle kann der Schwefel-Ligand oxidiert oder reduziert und dementsprechend Zink freigesetzt oder gebunden werden. Somit besteht eine Verbindung zwischen dem zellulären Redoxstatus und der zellulären Zinkverteilung [9].

Basenexzisions-und DNA-Einzelstrangbruchreparatur

6Für die Entfernung kleiner DNA-Basenschäden und DNA-Strangbrüche sind die Basenexzisionsreparatur (BER) und die DNA-Einzelstrangbruchreparatur (SSBR) verantwortlich.

7Eine der häufigsten oxidativen DNA-Basenmodifikationen ist 8-OxoG. 8-OxoG ist potentiell mutagen, da es in replizierenden Zellen zu GC→TA Transversionen führt [10].

88-OxoG wird durch die 8-Oxoguanin-DNA-Glykosylase-1 (OGG1) erkannt, die die N-glykosidische Bindung zwischen geschädigter Base und Zucker-Phosphat-Rest hydrolytisch spaltet, wodurch eine apurinische (AP-) Stelle entsteht. Die OGG1 verfügt als bifunktionelle Glykosylase über eine APLyase-Funktion und führt zum Einschneiden des DNA-Strangs auf der 3´Seite der Desoxyribose, woraus ein DNA-Einzelstrangbruch resultiert. Der verbleibende Desoxyribosephosphatrest wird durch die APE-1 entfernt. In die dadurch entstehende Lücke fügt die Polymerase ß (Pol ß) ein neues Nukleotid ein, und die Ligase IIIα (Lig IIIα) schließt die Lücke (Abbildung 1A) [11]. Bei der SSBR erfolgt die Schadenserkennung durch Poly(ADP-Ribose) Polymerasen (PARPs), von denen die PARP-1 die höchste katalytische Aktivität hat. PARP-1 ist ein im Zellkern lokalisiertes Zinkfingerprotein, welches an DNA-Strangbrüche bindet und dadurch aktiviert wird. Sie katalysiert den Transfer von ADP-Ribose-Einheiten vom Substrat NAD+ u.a. auf sich selbst (Automodifikation) und auf Histone. Diese Poly(ADP-Ribosyl)ierung rekrutiert u.a. das DNA-Reparaturprotein XRCC1 zum Schaden. Ebenso wie bei der BER erfolgen Prozessierung und Ligation durch die Pol ß und Lig IIIα (Abbildung 1B) [12].

Abbildung 1: Schematischer Ablauf der BER (A) und der SSBR (B).

Ergebnisse und Diskussion

9Das Spurenelement Zink ist essentiell für die Aufrechterhaltung der genomischen Stabilität. Eine intakte Zinkhomöostase ist die Voraussetzung für die fehlerfreie Funktion der biochemischen Prozesse. Überschüssiges „freies“ intrazelluläres Zink kann über seine hohe Affinität zu SH-Gruppen die Funktion von Proteinen nachteilig verändern. Daher stellt sich die Frage, welche Auswirkungen bereits kleine Änderungen der intrazellulären „freien“ Zinkkonzentration auf das Ausmaß oxidativer DNA-Schäden in der Zelle haben, indem beispielsweise detoxifizierende Enzyme sowie DNA-Reparaturproteine beeinflusst werden.

10Um zu untersuchen, welchen Einfluss Zink auf die genomische Stabilität hat, betrachteten wir sowohl die direkten als auch die indirekten Auswirkungen von Zink auf die DNA-Integrität. Eine direkt schädigende Wirkung, z.B. über die Induktion von DNA-Einzelstrangbrüchen, konnte nicht nachgewiesen werden. Zink scheint vielmehr einen indirekten Einfluss auf die genomische Stabilität über die Inhibierung von detoxifizierenden Enzymen und DNA-Reparaturprozessen auszuüben.

Einfluss von Zink auf den zellulären Redoxstatus

11Wir untersuchten den Einfluss von Zink auf H2O2-generierte DNA-Einzelstrangbrüche mittels Alkalischer Entwindung (AU) [13]. Als Zellmodell dienten Epithelzellen des Schweinedünndarms (IPEC-J2) [14]. Die Ergebnisse zeigten eine synergistische Steigerung von H2O2-induzierten DNA-Einzelstrangbrüchen nach 1 h Vorinkubation mit ZnSO4. Der zugrunde liegende Mechanismus dieser beobachteten Zunahme der H2O2-induzierten DNA-Einzelstrangbrüche muss im Weiteren noch geklärt werden. Möglicherweise beruht der Effekt auf der Inhibierung detoxifizierender Enzyme.

12In der Literatur gibt es bereits erste Anhaltspunkte, dass Zink mit dem GSH/GSSG System interferiert, nicht aber die Katalase beeinflusst. Bishop et al. konnten nach 6 h Inkubation ab 150 µM Zinkacetat einen erhöhten GSSG-Gehalt in intakten Astrozyten aus neugeborenen Wistarratten nachweisen. Die Autoren vermuteten eine Inaktivierung der Glutathionreduktase (GR) über einen NADPH-abhängigen Mechanismus [15]. Weitere Untersuchungen zeigten, dass Zink-Pyrithion in den zellulären Redoxstatus eingreift, indem es den zellulären Gehalt an Nicht-Protein-Thiolen (z.B. GSH) im nanomolaren bis micromolaren Bereich erniedrigt [16]. Zudem wurde eine Hemmung der isolierten GP nachgewiesen [17].

13Zusätzlich existieren in der Literatur Hinweise, dass erhöhte Zink-Konzentrationen an der Bildung von ROS beteiligt sind, indem Zink die Autoxidation von SH-Gruppen auf der Zellmembran [18] fördert, die Thiolreduktase [19] inhibiert sowie die Aktivität der NADPH Oxidase [20] steigerte.

Einfluss von Zink auf die BER und SSBR

14Neben der Beeinflussung des zellulären Redoxstatus ist die Effektivität der vorhandenen Reparaturmechanismen für die genomische Stabilität von entscheidender Bedeutung.

15Dabei können DNA-Reparaturproteine mit ihren Cystein-und Histidinseitenketten potentielle Angriffspunkte bei überschüssigem Zink sein. Im Mittelpunkt unserer Untersuchungen standen v.a. die OGG1 sowie die PARP-1.

16Mittels eines nicht-radioaktiven Cleavage Assays [21] untersuchten wir den Einfluss von Zink auf die OGG1 in intakten Zellen und Proteinextrakten, gewonnen aus IPEC-J2 Zellen. Während Zink die OGG1-Aktivität in intakten Zellen nicht beeinflusste, führte die direkte Behandlung der Proteinextrakte mit ZnSO4 zu einem signifikanten, konzentrationsabhängigen Aktivitätsverlust der OGG1 ab 75 µM. Mögliche Angriffspunkte innerhalb der OGG1 stellen die Aminosäurereste Cys253 und Cys255 dar, die nahe des aktiven Zentrums lokalisiert sind [22]. In der Literatur gab es bereits Hinweise, dass Zink mit der OGG1 interferiert, allerdings im isolierten System und mit der murinen OGG1 (mOGG1). Konzentrationen größer 100 µM ZnCl2 inhibierten die Basenexzision sowie den Einschnitt in das Zucker-Phosphat-Rückgrat der DNA. Der Einschnitt in den DNA-Strang wurde bei 100 µM ZnCl2 moderat aktiviert [23].

17Da wir eine Hemmung der OGG1 im subzellulären System beobachteten, untersuchten wir im nächsten Schritt die Auswirkung von Zink auf die Reparatur oxidativer DNA-Basenmodifikationen. Im zellulären System zeigte sich eine deutlich verlangsamte Reparatur der durch sichtbares Licht induzierten DNA-Schäden in Anwesenheit von Zink bei nicht-zytotoxischen Konzentrationen im Vergleich zur Kontrolle.

18Als nächstes untersuchten wir den Einfluss von Zink auf die PARP-1. Wir konnten zeigen, dass die Poly(ADP-Ribosyl)ierung in Kernextrakten aus IPEC-J2 Zellen signifikant durch eine Inkubation mit ZnSO4 erniedrigt wurde. Diese Zink-vermittelte Inhibierung der PARsylierung konnte durch Metallchelatoren vollständig revertiert werden, wohingegegen Thiolreagenzien den Effekt nur partiell revertierten. Um zu untersuchen, ob die Inhibierung der PARsylierung auf eine direkte Interaktion der PARP-1 mit Zink zurückzuführen ist, quantifizierten wir die Aktivität der isolierten PARP-1 in Gegenwart von Zink. Hier zeigte sich eine konzentrationsabhängige Abnahme der PARsylierung.

19Die PARP-1 besitzt außerhalb ihrer Zinkfingerstrukturen SH-Gruppen in der Automodifikationsdomäne (Cys429) sowie in der katalytischen Domäne (Cys845 und Cys908), die potentielle Zielstrukturen darstellen. Eine fast vollständige enzymatische Inaktivierung der PARP-1 resultierte aus der Mutagenese des Cys908 [24]. Die partielle Revertierung der Zinkvermittelten Hemmung durch Thiolreagenzien deutet auf die Wechselwirkung von Zink mit kritischen SH-Gruppen außerhalb der Zinkfingerbindenden Strukturen der PARP-1 hin.

Zusammenfassung

20Da Zink an einer Vielzahl biochemischer Prozesse innerhalb der Zelle beteiligt ist, stellt eine strikt regulierte Zinkhomöostase eine wichtige Voraussetzung für die Aufrechterhaltung der genomischen Stabilität dar.

21Gezielt freigesetzte Zink-Ionen stellen in der Zelle ein sehr potentes Signal dar und wirken spezifisch auf Proteine und die damit verbundenen zellulären Prozesse. Eine erhöhte „freie“ intrazelluläre Zink-Ionenkonzentration kann jedoch zu unspezifischen Reaktionen mit kritischen SH-Gruppen von Proteinen führen und adverse Folgen nach sich ziehen.

22Wir konnten zeigen, dass Zink die DNA nicht direkt, aber indirekt schädigt, indem es in den zellulären Redoxstatus eingreift und DNA-Reparaturproteine hemmt. Zink erhöhte synergistisch H2O2-generierte DNA-Einzelstrangbrüche. Dieser Effekt steht womöglich in Zusammenhang mit einem durch Zink veränderten GSH/GSSG System. Die untersuchten DNA-Reparaturproteine, OGG1 und PARP-1, verfügen über kritische SH-Gruppen, die potentielle molekulare Zielstrukturen darstellen. Zink bewirkte einen Aktivitätsverlust beider Proteine im subzellulären System. Ebenso konnten wir eine verlangsamte Reparatur gegenüber oxidativer DNA-Basenmodifikationen in Anwesenheit von Zink im zellulären System beobachten.

23Die Ergebnisse machen deutlich, dass Zink, obwohl es in gut reguliertem Zustand unerlässlich für die Aufrechterhaltung der genomischen Stabilität ist, im Falle erhöhter Konzentration an „freien“ Zink-Ionen zu oxidativem Stress und der Hemmung von DNA-Reparaturprozessen führen kann.

Abbildung 2: Einfluss von Zink auf die antioxidative Abwehr sowie der DNA-Reparatur bei intakter (A) und gestörter (B) Zinkhomöostase. ZnTs, ZIPs und MT sind an der Regulierung der Zinkhomöostase beteiligt. (A) Zink ist essentieller Bestandteil u.a. von detoxifizierenden Enzymen und DNA-Reparaturproteinen und damit an der Aufrechterhaltung der genomischen Stabilität beteiligt. (B) Überschüssiges intrazelluläres „freies“ Zink kann über die Bindung an kritischen SH-Gruppen Proteine inaktivieren und damit zelluläre Prozesse beeinträchtigen.

Danksagung

24Die Arbeit wurde durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Sonderforschungsbereich 852/1) finanziell unterstützt.

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Table des illustrations

Légende Abbildung 1: Schematischer Ablauf der BER (A) und der SSBR (B).
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Légende Abbildung 2: Einfluss von Zink auf die antioxidative Abwehr sowie der DNA-Reparatur bei intakter (A) und gestörter (B) Zinkhomöostase. ZnTs, ZIPs und MT sind an der Regulierung der Zinkhomöostase beteiligt. (A) Zink ist essentieller Bestandteil u.a. von detoxifizierenden Enzymen und DNA-Reparaturproteinen und damit an der Aufrechterhaltung der genomischen Stabilität beteiligt. (B) Überschüssiges intrazelluläres „freies“ Zink kann über die Bindung an kritischen SH-Gruppen Proteine inaktivieren und damit zelluläre Prozesse beeinträchtigen.
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Auteurs

Karlsruher Institut für Technologie (KIT), Abteilung für Lebensmittelchemie und Toxikologie, Adenauerring 20 a (Geb. 50.41), 76131 Karlsruhe
Email: elisa.schulze@kit.edu

Karlsruher Institut für Technologie (KIT), Abteilung für Lebensmittelchemie und Toxikologie, Adenauerring 20 a (Geb. 50.41), 76131 Karlsruhe

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